安普霉素对猪源大肠杆菌野生型折点及其耐药机制研究

论文摘要

抗菌药物敏感性判定标准（折点）是检测细菌对抗菌药物敏感性,确定其耐药水平及耐药率的重要技术标准,目前世界上较权威的制定折点的机构主要有美国临床实验室标准化研究所（CLSI）和欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）,我们国家尚未建立制定折点的机构。安普霉素是畜禽专用抗菌药,在治疗和预防大肠杆菌所引发的疾病中发挥了重要作用,但目前国内外均未建立安普霉素对大肠杆菌的敏感性折点,缺乏判定的统一尺度。随着抗菌药物长时间不合理使用和滥用,大肠杆菌耐药情况愈发严重。针对以上问题,本研究参考CLSI建立折点的标准流程与方法,结合我国不同地区养殖情况,采集国内不同区域养猪场猪的肛门拭子,在分离、纯化、鉴定大肠杆菌和测定安普霉素对上述大肠杆菌最小抑菌浓度（MIC）的基础上建立安普霉素对猪源大肠杆菌的野生型折点(COWT),并从钝化酶基因和外排泵基因两个方面探讨了大肠杆菌对安普霉素耐药性的影响,研究结果对安普霉素耐药大肠杆菌的监测以及细菌耐药性的防控具有重要的理论与实践意义。本研究采集了7个不同省市规模化养猪场的猪肛拭子,经分离、纯化、鉴定得到1230株猪源大肠杆菌。采用微量肉汤稀释法测定安普霉素对上述猪源大肠杆菌临床分离株的最小抑菌浓度（MIC）,通过绘制安普霉素对菌株的MIC值分布直方图,运用统计学方法确定了猪源大肠杆菌对安普霉素的COWT为32μg/mL。MIC50和MIC90分别为16μg/mL和64μg/mL。采用体外药效学试验方法测定安普霉素对部分猪源大肠杆菌临床分离株的最小杀菌浓度（MBC）和最小防突变浓度（MPC）。结果表明,安普霉素对猪源大肠杆菌为杀菌型抗菌药（MBC=14MIC）,突变选择窗较宽。在测得的MIC（0.5256 g/mL）范围内挑选出310株不同MIC值的猪源大肠杆菌临床分离株,采用PCR方法检测介导安普霉素耐药性的基因aac（3）-IV、npmA和apmA。结果只检测出aac（3）-IV钝化酶基因,且主要存在于MIC≥64μg/mL的耐药猪源大肠杆菌临床分离株中,表明aac（3）-IV钝化酶基因是介导大肠杆菌对安普霉素耐药的主要原因之一,同时也说明本研究中建立的野生型折点是可信的。随机挑选出25株对安普霉素耐药的猪源大肠杆菌临床分离株,对其耐药机制做进一步研究。首先采用药敏纸片法测定上述临床分离株对11种抗菌药物的耐药表型。采用微量肉汤稀释法和药敏纸片法分别检测上述菌株加入主动外排抑制剂碳酰氯间氯苯腙（CCCP）前后对安普霉素和其他抗菌药物的敏感性影响。结果显示CCCP和抗菌药物联合使用可有效降低猪源大肠杆菌对安普霉素、多西环素、新霉素等抗菌药物的耐药性。说明了主动外排系统可能是导致菌株对安普霉素耐药和多重耐药性的原因之一。分别采用PCR方法和实时荧光定量PCR方法检测上述判定为主动外排泵表达阳性的安普霉素耐药大肠杆菌临床分离株中AcrAB-TolC主动外排基因的携带率和相对表达量,分析猪源大肠杆菌主动外排基因acrA、acrB和aac（3）-IV钝化酶基因的相对表达量与猪源大肠杆菌临床分离株对安普霉素耐药程度的相关性。结果显示25株耐安普霉素的猪源大肠杆菌临床分离株中acrA、acrB和tolC 3种主动外排基因的携带率较高;部分对安普霉素耐药严重的猪源大肠杆菌临床分离株中acrA、acrB基因相对表达量较高,但其表达量的高低和猪源大肠杆菌临床分离株对安普霉素耐药程度无明显相关性;aac（3）-IV钝化酶基因的相对表达量与猪源大肠杆菌临床分离株对安普霉素耐药程度无明显相关性。采用实时荧光定量PCR方法检测上述多重耐药大肠杆菌临床分离株中主动外排基因acrA和acrB及其调控基因marA,soxS,robA的相对表达量,分析多重耐药菌株耐药数量与上述基因表达量的关系。结果表明acrA、acrB两种主动外排基因和marA,soxS两种调控基因的表达量与大肠杆菌的耐药数量呈正相关,robA基因的表达量与耐药数量无明显相关性。综上所述,我们初步确定了安普霉素对猪源大肠杆菌的COWT,并对部分猪源大肠杆菌临床分离株的耐药机制进行了研究,从钝化酶基因和外排泵基因两个方面探讨了大肠杆菌对安普霉素耐药性的影响,研究结果对指导猪源大肠杆菌安普霉素耐药性监控及防治具有重要的理论与实践意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
•   1.1 大肠杆菌概述
•     1.1.1 大肠杆菌的致病性
•     1.1.2 大肠杆菌的耐药现状
•     1.1.3 大肠杆菌的耐药机制
•   1.2 安普霉素的概述
•     1.2.1 安普霉素的抗菌作用
•     1.2.2 安普霉素的耐药机制
•   1.3 大肠杆菌外排泵与其耐药性的概述
•     1.3.1 AcrAB-TolC的主动外排系统
•     1.3.2 AcrAB-TolC的主动外排系统的结构及调控
•     1.3.3 外排泵抑制剂的概述
•   1.4 药物敏感性判定标准（折点）
•     1.4.1 制定折点的组织及折点分类
• WT)'>    1.4.2 野生型折点(CO_WT)
•   1.5 研究目的与意义
• 2 材料与方法
•   2.1 技术路线
•   2.2 试验材料
•     2.2.1 菌株
•     2.2.2 主要仪器设备
•     2.2.3 试剂
•     2.2.4 培养基和常用溶液配制
•   2.3 试验方法
•     2.3.1 猪源大肠杆菌的分离
•     2.3.2 猪源大肠杆菌的鉴定
•     2.3.3 安普霉素对猪源大肠杆菌临床分离株最小抑菌浓度（MIC）的测定
•     2.3.4 安普菌素对猪源大肠杆菌临床分离株野生型折点的确定
•     2.3.5 安普霉素对猪源大肠杆菌临床分离株最小杀菌浓度（MBC）和防突变浓度（MPC）的测定
•     2.3.6 PCR扩增猪源大肠杆菌临床分离株中aac（3）-IV、npmA与 apmA基因
•     2.3.7 猪源安普霉素耐药大肠杆菌临床分离株对其他抗菌药物的敏感性研究
•     2.3.8 PCR检测多重耐药大肠杆菌临床分离株中acrA,acrB,tolC基因
•     2.3.9 CCCP对安普霉素及其他抗菌药物耐药性的影响
•     2.3.10 猪源安普霉素耐药大肠杆菌临床分离株中acrA、acrB及 aac（3）-IV基因相对表达量的检测
•     2.3.11 多重耐药大肠杆菌临床分离株主动外排基因及其调控基因相对表达量的测定
• 3 结果与分析
•   3.1 大肠杆菌的分离
•   3.2 大肠杆菌的鉴定
•     3.2.1 革兰氏染色镜检
•     3.2.2 大肠杆菌的生化鉴定
•     3.2.3 PCR扩增16sDNA鉴定
•   3.3 安普菌素对猪源大肠杆菌临床分离株的最小抑菌浓度
• WT的确定'>  3.4 安普霉素对猪源大肠杆菌临床分离株CO_WT的确定
•   3.5 安普霉素对20株猪源大肠杆菌临床分离株的MIC、MBC和 MPC的测定
•   3.6 PCR检测猪源大肠杆菌临床分离株中aac（3）-IV、npmA与 apmA基因
•     3.6.1 PCR检测aac（3）-IV、npmA与 apmA基因
•     3.6.2 aac（3）-IV钝化酶基因在猪源大肠杆菌中的流行性分布
•   3.7 猪源安普霉素耐药大肠杆菌临床分离株对11 种抗菌药物敏感性
•   3.8 PCR检测猪源多重耐药大肠杆菌临床分离株中acrA,acrB,tolC基因
•   3.9 CCCP对安普霉素及其他抗菌药物敏感性的影响
•     3.9.1 CCCP对安普霉素MIC影响
•     3.9.2 CCCP对其他抗菌药物敏感性的影响
•   3.10 猪源大肠菌株临床分离株对安普霉素耐药程度与相关基因表达量的相关性
•     3.10.1 猪源大肠杆菌临床分离株对安普霉素耐药程度与acrA、acrB基因相对表达量的相关性
•     3.10.2 猪源大肠杆菌临床分离株对安普霉素耐药程度与aac（3）-IV基因相对表达量的相关性
•   3.11 猪源大肠杆菌主动外排基因及其调控基因相对表达量与多重耐药性的相关性
•     3.11.1 猪源大肠杆菌主动外排基因表达量与多重耐药性的相关性
•     3.11.2 猪源大肠杆菌主动外排调控基因表达量与多重耐药性的相关性
• 4 讨论
•   4.1 猪源大肠杆菌耐药现状的分析
• WT的确定'>  4.2 安普霉素对猪源大肠杆菌CO_WT的确定
•   4.3 安普霉素体外药效学特点
•   4.4 猪源大肠杆菌对安普霉素的耐药性分析
•     4.4.1 钝化酶基因aac（3）-IV介导大肠杆菌对安普霉素耐药性的分析
•     4.4.2 大肠杆菌外排泵介导大肠杆菌对安普霉素耐药性的分析
•   4.5 猪源多重耐药大肠杆菌与AcrAB-TolC主动外排基因及其调控基因相对表达量的分析
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李佳瑞

导师: 张秀英

关键词: 安普霉素,猪源大肠杆菌,野生型折点,耐药机制,主动外排系统

来源: 东北农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 东北农业大学

分类号: S852.61

总页数: 67

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