一、人巨细胞病毒UL149基因在临床低传代分离株中的多态性研究（论文文献综述）
尹晓波,毛志芹,常淑婷,吉耀华,何蓉,齐莹,阮强,孙梅,马艳萍,孙峥嵘[1]（2012）在《人巨细胞病毒UL147基因在婴儿巨细胞病毒肝炎临床株中的多态性》文中研究指明目的:探讨人巨细胞病毒（human cytomegalov-irus,HCMV）UL147基因在婴儿巨细胞病毒肝炎临床株中的多态性及其与致病性之间的关系.方法:对25株经荧光定量PCR方法检测HCMVDNA为阳性的临床株的尿液上清液进行HCMVUL147全序列PCR扩增,并对PCR扩增产物进行序列测定及分析.结果:25株临床株扩增阳性产物进行HCMVUL147全序列PCR扩增,结果有19株PCR扩增阳性;与HCMVToled株进行序列比较分析,所有UL147开放读码框架（open-reading-fraem,ORF）长度在477-480bp,序列呈现较高多态性,UL147基因变异率为2.7%-10.9%;氨基酸变异集中在30-40氨基酸位点,变异率为4.3%-8.75%;所有研究标本中没有序列与Toledo完全一致.序列差异多位于序列的5’端,巨细胞病毒肝炎患儿和无症状患儿之间的UL147基因DNA序列是一致的.NCBIPROS数据库预测UL147编码蛋白功能区显示几乎所有的UL147序列中都存在1个CKP和1个PKC位点.结论:巨细胞病毒肝炎患儿临床株中的HCMVUL147基因序列呈现高度多态性.UL147基因多态性与其对肝脏损害的程度无关.
何蓉,阮强,齐莹,马艳萍,吉耀华[2]（2009）在《人巨细胞病毒UL143基因在临床低传代分离株中的多态性研究》文中研究说明目的探讨人巨细胞病毒（human cytomegalovims,HCMV）UL143序列在临床患儿低传代分离株中的多态性及其与临床疾病的关系。方法对19株HCMV临床低传代分离株进行HCMV-UL143 PCR扩增分析及全序列测定分析。结果19株HCMV感染患儿临床分离株均因碱基插入造成移码突变,开放阅读框架（ORF）比Foledo株短。根据序列变异情况可将19个序列分为2组,第1组16个序列新增一个MYRISTYL位点;缺失2个PKC磷酸化位点。未发现黄疸、小头畸形、先天性巨结肠等不同疾病类型的序列之间的差异。结论HCMV-UL143较多存在于临床低传代分离株中,序列呈现一定多态性。
王岳平,阮强,吉耀华,孙峥嵘,何蓉,齐莹,马艳萍[3]（2009）在《黄疸患儿感染的人巨细胞病毒UL149基因编码产物结合多肽的氨基酸序列分析》文中进行了进一步梳理目的:初步确定能够与黄疸患儿感染的人巨细胞病毒UL149基因编码产物具有较强结合能力的多肽,并分析这些多肽氨基酸序列的特点.方法:应用多肽文库展示技术筛选与来源黄疸患儿的人巨细胞病毒临床低传代分离株UL/b’区基因中的UL149基因编码产物结合的多肽克隆,对相应的多肽氨基酸序列进行同源性比较,并与蛋白数据库中已知的蛋白序列进行比较.结果:与黄疸患儿感染的人巨细胞病毒UL149基因编码产物具有结合能力的多肽序列之间具有较高的同源性,氨基酸序列中存在较为集中的区域,即D/E-D/E-G-W/F/I/L;与已知蛋白数据库进行比较,发现与人免疫球蛋白重链可变区关系密切,亦与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、人巨细胞病毒的立刻早期基因UL37、gpB等存在结合关系.结论:在黄疸患儿感染的人巨细胞病毒UL149基因编码产物可能与人巨细胞病毒的gpB、立刻早期基因UL37等具有联合作用,并且可能参与HCMV的免疫逃避机制.
扶星星[4]（2009）在《gB、UL144、UL133基因在人类巨细胞病毒临床株中的多态性研究》文中指出人类巨细胞病毒（HCMV）是最复杂的DNA病毒之一,是形成终身感染的一个重要病原体,全世界正常人群的HCMV带毒率达到50-100%。虽然通常情况下,受感者不具临床症状,但对于免疫低下人群（AIDS病人、器官移植患者、婴幼儿等）,巨细胞病毒感染常导致各种临床病症,甚至危及生命。目前,对巨细胞病毒基因遗传多态性与受感者临床症状的关系仍了解甚少。人类巨细胞病毒在多次传代后,会表现出不同的毒力水平,细胞嗜性也发生改变。与临床低传代株Toledo相比,实验室高传代株AD169缺失了19个开放阅读框（ORF）,这19个基因被认为是与HCMV致病性最可能相关的一组基因。研究这些基因的多态性对揭示HCMV致病性的遗传基础具有指导意义。为了探讨巨细胞病毒基因多态性对病毒毒力的影响,我们从先天性巨细胞病毒感染或后天感染的患儿尿液中分离到23株巨细胞病毒,测定并分析了UL144全长和gB的部分序列,没有发现gB和UL144基因型与患儿临床结果之间的显着性关联。23个患儿中,13个患儿（57%）为UL144 1A型,3个患儿（13%）为UL144 2型,7个患儿（30%）为UL144 3型。本研究中,没有发现UL144基因型1B和1C型,而在美国病毒株中,UL144 1B和1C型较为常见。gBⅠ、Ⅲ型和UL144 1A、2、3型临床株均能从母亲垂直传播给胎儿。UL133基因是这19个ORF中的一个,本研究以临床低传代株Toledo和Merlin为对照,分析了23个临床病毒株UL133基因的遗传多态性。序列分析表明,UL133基因具有一定的多态性,我们将Toledo株、Merlin株与本次分离到的临床株一起分为Group1、Group2、Group3共3个基因型。G2、G3型毒株均能导致先天性感染,没有发现UL133基因型与患儿临床结果的必然关联。
吉耀华,阮强,何蓉,齐莹,马艳萍,孙峥嵘,刘庆,王继东[5]（2008）在《人巨细胞病毒UL150基因在临床低传代分离株中的多态性研究》文中认为目的研究人巨细胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）UL150序列在临床低传代分离株中的多态性,探讨HCMV基因多态性与其感染引起不同临床症状之间的关系。方法对29株经荧光定量PCR方法（Q-PCR）检测HCMV-DNA为阳性的临床低传代分离株进行HCMV UL150全序列PCR扩增,并对PCR扩增产物进行序列测定及分析。结果在29株临床低传代分离株中25株PCR扩增阳性,其中18株完成了测序。18株临床分离株HCMV UL150开放阅读框架（open reading frame,ORF）与HCMV Toledo株相应序列进行比较分析,显示18株低传代临床分离株的HCMV UL150 ORF均为1920bp,编码蛋白含有640个氨基酸,临床株的ORF及编码的氨基酸序列的长度均与Merlin株一致。结论HCMV UL150基因在临床分离株中存在着高度的多态性,未发现其与HCMV感染不同临床症状间存在明显的关系。
马艳萍[6]（2008）在《人巨细胞病毒UL141基因多态性和转录子结构分析以及人巨细胞病毒全长cDNA文库构建》文中认为人巨细胞病毒（Human Cytomegalovirus HCMV）感染在人群中普遍存在，世界多数国家育龄妇女HCMV IgG抗体阳性率在76％以上，活动感染达6．3％，母婴垂直传播率高达35％。国内一些学者报道我国婴儿先天性HCMV感染发病率占1．2-12％不等。据此推测我国每年由HCMV先天感染所致伤残儿约4万名。HCMV先天感染引起的疾病或畸形主要包括：黄疸性肝炎、胆道闭锁、先天性巨结肠、小头畸形，以及智力低下等神经系统畸形等。至今为止，HCMV先天感染的致病机理尚不清楚。HCMV感染的不同临床表现和组织趋向性，可能与宿主的免疫状态有关，但病毒的自身结构，尤其是与病毒毒力、组织嗜性和与病毒逃避机体免疫的相关基因的差异，可能是决定HCMV先天感染病情轻重及引起何种器官受损的内在因素。1996年Cha等研究发现，在Toledo等临床低传代分离株中存在一个新的DNA区域，这个区域至少包括UL133-UL151共19个开放阅读框架ORFs（open readingframe），而在实验室株AD169中却不存在这一区域。作者推测，实验室株在细胞培养反复传代过程中出现了UL／b’区遗传信息的丢失和重排，导致HCMV毒力和致病性的明显减弱。因此，UL／b’区基因可能在HCMV致病过程中发挥重要作用。目前，关于H（?）MV UL／b’区基因的结构特点和表达产物功能的研究成为国际HCMV致病机理研究领域最活跃的部分。UL144基因是一个具有高度多态性的基因，编码一种Ⅰ型跨膜糖蛋白，是一种疱疹病毒穿入介子（HveA或HveM）的类似分子，HveA是肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族成员之一。研究发现，UL144基因分型可能与HCMV先天感染致病性有关。在这一区域中另一个具有高度多态性的是UL146基因。UL146和UL147基因编码产物一种α趋化因子，通过损伤外周血白细胞，特别是中性粒细胞影响宿主的免疫应答。UL146基因呈现多个基因型，但在个体内基因的变化高度保守。最新的研究结果表明UL141蛋白能够通过下调受累细胞上的NK细胞激活受体的配体CD155的表达，从而逃避NK细胞的杀伤作用。但目前尚无来自HCMV先天感染分离株的UL141基因序列分析的研究报道。Cha等对UL141基因的转录子结构进行了推测。研究发现在UL138与UL139之间的非编码区存在两个TATA序列，UL141与UL142之间的非编码区及μl142ORF内分别存在两个POLY（A）信号，而跨越UL139、UL140及UL141三个ORF的约2．5kb片断中无转录信号。说明这三个基因可能共用其中的转录信号，转录和表达可能存在某种联系。这种转录方式是否真的存在，这是否预示着这三个基因功能之间存在某种联系。在已经获得的人巨细胞病毒一些基因的mRNA结构中发现，人巨细胞病毒存在复杂的转录表达形式，并且基因mRNA结构的变化影响其功能的变化。UL57基因包含在3个不同转录子当中，这些转录子的5’末端分布在UL57基因起始密码上游800bp片段的不同位置，3’末端则跨越更大的范围，最大的一个转录子3’末端终止在UL51基因下游的PolyA信号处。UL57基因不同转录子受不同转录起始位点的调控。又如，UL4基因的mRNA5’端上游含有232个核苷酸的非编码序列，其中含有3个AUG起始信号，产生了一些小的阅读编码框。其中，第二个阅读编码框的编码产物能够抑制下游的UL4基因的表达。2000年，首次发现HCMV编码一个IL-10的类似物，根据mRNA结构分析发现，其基因起始位置与UL111A基因一致，而比UL111A基因提前终止。该基因包括3个外显子和2个内含子。可见，HCMV基因组的转录过程无论在转录子种类，mRNA拼接以及表达调控等各方面，都具有非常复杂的机制，与这些复杂机制对应的是复杂的mRNA结构。因此获得HCMV基因的转录子结构是揭示其致病机理的前提条件。本研究分别在基因的DNA水平探讨UL141基因在临床低传代分离株中的多态性及其与HCMV先天感染不同致病性之间的关系，并且从转录水平研究UL141基因能够转录出哪些转录子，进而获得转录子的一级结构。为进一步探讨HCMVUL／b’区其它基因乃至整个基因组其他基因的转录子结构，本研究构建了HCMV全长cDNA文库，为进一步探讨预测基因的表达潜力，研究HCMV转录子结构和基因表达调控奠定基础。材料和方法一、标本来源1、用于UL141基因多态性研究的31例标本包括29株低传代临床分离株和2例尿标本。29株分离株均来中国医科大学附属盛京医院1988-1993年住院患儿。2000年应用荧光定量PCR方法检测HCMV-DNA，结果均为阳性。2例尿标本来自2003年中国医科大学附属盛京医院疑似HCMV先天感染住院患儿。另外，本研究中的序列与从Genbank上获得的其他8个临床分离株的UL141基因序列进行了序列的比较。2、用于UL141基因转录子结构研究和构建HCMV全长cDNA文库的分离株均来自2006至2007年中国医科大学附属盛京医院的住院患儿，年龄小于5个月。临床表现包括：巨细胞病毒性肝炎，多器官畸形、巨细胞病毒性肺炎等。应用荧光定量PCR（QPCR）方法检测患儿尿液HCMV-DNA，结果为阳性。二、实验方法（一）UL141基因多态性研究1、标本处理，提取DNA（1）临床分离株：取HCMV低传代分离株接种细胞的培养上清液与等量裂解液（华美生物工程公司）混合，煮沸15min，作为扩增模板。（2）尿标本：取1ml尿标本，15000rpm／min离心15min，弃上清，加DNA裂解液50μl，混匀，离心数秒。100℃煮沸10min，15000rpm／min离心5min，-70℃保存备用。2、PCR扩增（1）引物设计按照Toledo株序列（参考株，GenBank accessionmunberU33331），应用引物设计软件primer premier5．0设计用于扩增HCMV UL141片段的全序列引物、鉴定引物及分段PCR扩增分段引物（见表1）。引物也用于UL141基因测序。（2）PCR全序列扩增应用全序列引物及搭配引物（全序列及鉴定引物之一）和分段PCR引物扩增UL141基因全序列。制备反应体系如下：10×Buffer 5μl，Mgcl21．5mM，dNTPmixture 2．5μl（2．5mmol／L），上下游引物各1μl（33pmol／μ1），rTaq酶2U，模板3．5μl，用双蒸水补至总反应体积50μl。PCR循环条件见表1。表1，HCMV UL141基因PCR扩增引物和循环条件PCR产物经EB染色，1．5％琼脂糖凝胶电泳后，紫外检测仪下观察扩增结果。3、PCR产物纯化、回收及测序测序前所有扩增产物应用TakaRa公司的PCR Fragment Recovery kit切胶回收目的DNA片段，应用TakaRa公司的PCR Fragment Recovery kit试剂盒回收，以去除非特异产物带的干扰。PCR扩增阳性标本以UL141基因鉴定引物及分段引物测序，应用BigDye Terminators Cycle Sequencing Kit试剂盒，采用美国“ABI3700全自动DNA测序仪通过正反两个方向分别对目的基因的正链及负链进行测序，以增加实验结果的可信性。测序由上海联合基因公司完成。4、序列分析和提交序列分析应用生物信息学软件DNAClub、BioEdit、Genedoc、DNASis、DNAStar等完成。序列提交用Sequin软件向GenBank提交整理后的HCMV UL141 ORF序列。（二）UL141基因转录子结构研究实验方法1、HCMV分离株分离培养（1）第2-15代人胚肺细胞传代培养人胚肺细胞分别接种到5ml玻璃试管、25 cm2和75cm2培养瓶中，分别加入含15％胎牛血清的1640培养液1ml、6ml和12ml，在37℃，CO2浓度培养，每72小时换液一次，待用。（2）HCMV传代培养①HCMV原代接种取新鲜晨尿1．8ml加入1％的双抗（青霉素和链霉素）0．2ml，1500rpm／min离心15分钟。取0．3ml上清加入到人胚肺细胞已经长成单层的细胞管内，37℃吸附30分钟。倒掉吸附后的尿液，加Hank’s液洗一次，加1ml含2％胎牛血清的1640培养液，置37℃温箱中旋转培养。②HCMV传代培养取-80℃冻存的毒株迅速融化后，分别取毒株0．2ml、0．5ml和1．0ml接种在人胚肺细胞已经长成单层的细胞管、25 cm2或75cm2培养瓶内，加含2％胎牛血清的1640培养液分别至1ml、6ml和12ml。置37℃温箱中培养，其中细胞管细胞旋转培养。每48-72小时换液一次。每周观察细胞病变出现2-3次，待细胞病变达到75％～100％时，用吸管将细胞吹下，-80℃冻存待用。（3）毒株收集将5代毒株接种在长满单层人胚肺细胞的25cm2培养瓶中，待细胞病变达到75％～100％时，加入1ml Trizol,将病变的细胞吹下，-80℃冻存，用于中RNA提取。2、分离株UL／b’区基因DNA测序由上海英俊公司完成。3、样品总RNA抽提根据GIBCO BRL公司的Trizol reagent操作说明书进行。分光光度计测量OD260和OD280值。total RNA电泳，电泳条件：1．5％琼脂糖凝胶，EB染色；100V、20min。4、3’RACE（1）引物序列①3’RACE Outer Primer：5’TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT 3’②3’RACE Inner Primer：5’CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG 3’③UL141B 3’Outer Primer：5’CTGTTCTGGGTGCTGTTGAG3’④UL141B 3’Inner Primer：5’TCGGCTGATGAACGGACT3’⑤UL141 A 3’Outer Primer：5’CGC GAC TGA GCG TCC GGT TT 3′⑥UL141A 3’Inner Primer：5’CGT GGT AGT GAC CAC CGT GCG A 3′⑦逆转录引物：3′RACE Adaptor Primer（2）反转录反应反应体系：样品RNA1μl，3’RACE Adaptor（5μM）1μl，5×M-MLV Buffer 2μl，dNTP Mixture（10 mM each）1μl，RNase Inhibitor 10U，Reverse TranscriptaseM-MLV（RNase H-）50U／μl，RNase Free dH20 4．5μl，总体积10μl。反应条件：42℃，60min，70℃，15min。（3）Outer PCR反应反应体系：反转录反应液3μl，1×cDNA Dilution BufferⅡ7μl，UL141A3′RACE Outer Primer或UL141B 3’Outer Primer（10μM）2μl，3′RACE Outer Primer（10μM）2μl，10×LA PCR BufferⅡ(Mg2+Free)4μl，MgCl2（25mM）3μl，TaKaRaLA Taq 1．25U，dH2O 28．75μl，总体积50μl。反应条件：94℃3 min，94℃30 sec，55℃30 sec，20或30Cycles，72℃1 min 72℃10 min。PCR反应结束后，取5～10μ1的PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，确认PCR扩增产物。若没有得到目的扩增产物，可进行Inner PCR反应。（4）Inner PCR反应反应体系：1st PCR产物1μl，dNTP Mixture（2．5 mM each）8μl，10×LA PCRBufferⅡ(Mg2+Free)5μl，MgCl2（25 mM）5μl，TaKaRa LA Taq 2．5 U，UL141A3′RACE Inner Primer或UL141B 3’Inner Primer（10μM）0．5μl，3′RACE Inner Primer（10μM）2μl，dH2O，26．5μl，总体积50μl。反应条件：94℃3min，94℃30sec，55℃30sec，30 Cycles，72℃1 min，72℃10min。3’RACE扩增设从未接种HCMV的人胚肺细胞提取的总RNA样品作为阴性对照，以排除来自人胚肺细胞mRNA的假阳性干扰。5、5’RACE（1）引物①5’RACE Outer Primer：5’CATGGCTACATGCTGACAGCCTA 3’②5’RACE Inner Primer：5’CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG3’③UL141B 5’Outer Primer：5’GCGTGAGAATTACGAAGC 3’④UL141B 5’Inner Primer：5’CGGTACTGGAGTCCGTTCAT3’⑤逆转录引物：Random 9 mers以上引物也用于PCR产物的测序。（2）去磷酸化处理使用Alkaline Phosphatase（CIAP）对Total RNA中裸露的5’磷酸基团进行去磷酸反应。得到CIAP-treated RNA。3、“去帽子”反应使用Tobacco Acid Pyrophosphatase（TAP）去掉mRNA的5’帽子结构，保留一个磷酸基团。此反应液为CIAP／TAP-treated RNA。37℃反应1小时。（3）5’RACE Adaptor的连接酚氯仿抽提，异丙醇沉淀，70％冷乙醇（RNase Free dH2O配制）漂洗，严格按照说明书进行。加入6μl的RNase Free dH2O溶解沉淀，得到Ligated RNA。（4）反转录反应反转录体系10μl Ligated RNA 6μl，Random 9 mers（50 M）0．5μl，5×M-MLV Buffer 2μl，dNTP（10 mM each）1μl，RNase Inhibitor 10U，ReverseTranscriptase M-MLV（RNase H）50U。反应条件30℃10min，42℃1hr，70℃15min。（5）Otater PCR反应反应体系，反转录反应液3μl，1×cDNA Dilution BufferⅡ7μl，10×LA PCRBufferⅡ(Mg2+Free)4μl，MgCl（25mM）3μl，TaKaRaLA Taq1．25U，UL141B5’Outer Primer（10μM）2μl，5′RACE Outer Primer（10μM）2μl dH2O 28．75μl，总体积50μl。PCR反应条件94℃3min，94℃30sec，55℃30sec 20 Cycles72℃1min，72℃10min。（6）Inner PCR反应反应体系，Outer PCR反应液1μl，10×LA PCR BufferⅡ(Mg2+Free)5μl，MgCl（25 mM）5μl，dNTP Mixture（2．5 mM each）8μl，TaKaRa LA Taq（5 U／μl）0．5μl，UL141B 5’Inner Primer10μM)2μl，5′RACE Inner Primer（10μM）2μl，dH2O 26．5μl，总体积50μl。PCR反应条件94℃3min，94℃30sec，55℃30sec 30 Cycles 72℃1 min 72℃10 min。为提高5’RACE的可信度，同时设从未接种HCMV的人胚肺细胞提取的总RNA样品作为阴性对照，以排除来自人胚肺细胞mRNA的假阳性干扰。每个实验样品同时进行TAP（-）和M-MLV（-）的负对照实验。TAP（-）即：RNA经去磷酸化反应后不进行TAP处理，直接进行5’RACE Adaptor的连接及后续实验，以验证RNA去磷酸化是否充分。如果充分，RT-PCR将不能扩增。如果不充分，会有RT-PCR扩增结果，但其扩增片段长度一般不同于目的片段。M-MLV（-）即：5’RACEAdaptor连接反应后进行RT反应时不添加M-MLV，以排除基因组DNA污染造成的假阳性结果。如果M-MLV（-）的负对照实验没有特异性扩增，说明5’RACE结果来源于mRNA。电泳检测PCR结果。电泳条件：1．5％琼脂糖凝胶，EB染色；100V，20min。紫外检测仪下观察结果。6、PCR产物的直接测序和克隆测序由上海英俊公司完成。（三）构建HCMV cDNA文库实验方法1、HCMV分离株分离培养（同前）2、样品total RNA抽提（同前）3、mRNA纯化采用QIAGEN公司的Oligotex mRNA Kits试剂盒，严格按照说明书进行。分光光度计测量OD260和OD280值。4、cDNA合成、酶切及分级分离①cDNA第一链合成2μg样品RNA，1μl SMARTⅣOligonucleotide（10μM），1μl CDSⅢ／3′PCR Ptimer（10μM），加水至5μl。72℃温浴2 min，冰浴2 min。加入2．0μl 5XFirst-Strand Buffer（250mM Tris，30mM Mgcl2，375mM Kcl），1．0μl DTT（20 mM），1．0μl dNTP Mix（10 mM），1．0μl PowerScript Reverse Transcriptase，42℃温浴1 hr。将离心管置于冰上终止第一链合成。②LD PCR扩增cDNA100μl体系中含2μl cDNA第一链，10μl 10X Advantage 2 PCR Buffer，2μldNTP Mix（0．5M），2μl 5′PCR Primer（10μM），2μl CDSⅢ／3′PCR Primer（10μM），2μl 50X Advantage 2 Polymerase Mix，80μl去离子水。PCR：95℃1 min，95℃15 sec 68℃6 min，24个循环。③蛋白酶K消化向LD-PCR产物中加入2μl蛋白酶K（20μg／μl），45℃温浴20 min，加入50μl去离子水。酚氯仿抽提，乙醇沉淀，79μl去离子水溶解沉淀。④SfiⅠ消化反应体系100μl中含79μl cDNA，10μl 10X Sfi Buffer，10μl SfiⅠEnzyme（20unit／μl），1μl 100X BSA，充分混匀，50℃温浴2 hr。加2μl 1％二甲苯胺染料。⑤cDNA的分级分离准备好11个收集管，标记1～11，按试剂盒操作要求准备好spin-400柱子。用700μl的缓冲液洗柱子，待洗柱缓冲液流完，将上面的酶切产物约100μl平稳地加到胶层中间，直到产物全部渗到胶面下。加100μl缓冲液使染料层下降数毫米，放置好第一收集管。加600μl的缓冲液并开始收集滴出的液体，每管收集35μl。合并第2～7管，-20℃乙醇沉淀过夜。14，000 rpm离心20 min。弃上清，室温干燥10 min。加100μl去离子水溶解沉淀。4、将cDNA与pBluescriptⅡSK*载体相连10．0μl反应体系中1．0μl cDNA，1μl Vector（25 ng／ml），1μl 10X Ligation Buffer（500mMTris-HCl，100mM Mgcl2，100 mM DTT，0．5mg／ml BSA），1μl ATP（10 mM），1μl T4 DNA Ligase，5．5μl去离子水。16℃过夜。克隆载体为pBluescriptⅡSK的改造载体，具体是将EcoRⅠ和NotⅠ之间的序列改造为SfiⅠA和SfiⅠB接头序列，酶切后可定向插入cDNA片断（SfiⅠA→SfiⅠR）SfiⅠ位点在HCMV基因组中为稀有位点。5、重组质粒的转化取200μl感受态宿主菌（DH-5α）至灭菌的50ml离心管中，放置冰水浴融化。加入上述1μl连接液，轻轻混匀后置于冰上45min。42℃水浴热休克90sec，迅速放入冰上2min。加入2ml LB培养基（不含抗生素），37℃摇床，转速≤150rpm，复苏45min。3000rpm离心10 min收菌，用250μl LB重悬。取250μl菌液涂布于15cm培养皿上（Apr-IPTG／x-gal LB固体培养基），37℃过夜。6、克隆测序随机挑选26个克隆，5’端单向测序，其中部分克隆双向测序。结果一、UL141基因多态性（一）临床株UL141A核苷酸和氨基序列分析对29株低传代临床分离株和2个尿标本进行HCMV UL141全序列PCR扩增，20株分离株和1个尿标本阳性，总阳性率为67．7％。应用BioEdi软件对Toledo株及21个UL141基因核苷酸序列进行线形化比较，分析结果表明，所有低传代临床分离株和临床尿标本UL141基因在Toledo株UL141序列的核苷酸位点227均有核苷酸T的缺失（见图2a），产生两个新的ORF，分别命名为UL141A、UL141B（图2b．）。Toledo株UL141 ORF全长1278bp，所有临床分离株UL141A位于Toledo株UL141核甘酸序列第1至第316位，全长309bp或315bp，ORFb位于Toledo株UL141核甘酸序列第262至第1278位，全长1017bp。临床株UL141A核苷酸和氨基酸与Toledo株相应区域比较，同源性分别为95．9-98．7％和70．2-74．0％。10个分离株在Toledo株第78-83核苷酸位点有6个碱基的缺失，使预测编码蛋白质第26位氨基酸产生突变，由天冬氨酸突变为谷氨酸，而27、28位的甘氨酸和谷氨酸缺失。因所有临床分离株UL141A在Toledo株227核苷酸位点均缺失碱基T，造成移码突变，使预测编码蛋白质第76位以后的氨基酸产生大量变异（见图4）。（二）临床株UL141B核苷酸和氨基序列分析21个临床株和来源于Genbank的8个参考株UL141B核苷酸序列比较表明，UL141B高度保守。所有UL141B核苷酸序列同源性为96．9-100％，其中来自本研究中的21个核苷酸序列同源性为96．9-100％，来自于Genbank的8个核苷酸序列同源性为97．1-99．2％。UL141B预测编码蛋白质含有338个氨基酸，分子量为39KD。所有UL141B氨基酸序列高度保守，同源性达到97．6％-100％。（三）UL141A和UL141B进化树分析应用DNAStar软件包中的MegAlign软件进行UL141A和UL141B的进化树分析。在本研究中获得的来自不同临床表现的UL141A序列在进化树中的分布未发现明显规律（图6）。UL141B的进化树分析表明，来自Cardiff的四个参考株（6397，merlin，3157和3301）未能成为一组；未经传代的临床株和参考株84，W和3301分布在不同的分支中；来自本研究不同临床表现的分离株在进化树中的分布中亦未发现明显规律（图7）。二、UL141基因转录子结构研究（一）3’RACE和5’RACE扩增结果首先以UL141A 3’Outer Primer、UL141A 3’Inner Primer和3’RACE OuterPrimer、3’RACE Inner Primer对3个HCMV分离株进行3’RACE巢式扩增，分离株H和X扩增结果为阴性，分离株CH产生了一个DNA片段。用UL141B 3’OuterPrimer、3’RACE Outer Primer对3个HCMV分离株进行了3’RACE扩增，分离株H产生了一个1000bp左右的产物，而另外两个分离株扩增阴性。因此又使用UL141B 3’Inner Primer和3’RACE Inner Primer对3个分离株进行3’RACE巢式扩增，均产生了1个750bp左右的片段。未接种HCMV的人胚肺细胞总RNA样品做为阴性对照。3个分离株的5’RACE扩增产生了不同的扩增结果。分离株H为3个片段，分别约为500bp，200bp和100bp；分离株X为1个约500bp的片段；分离株CH为1个1000bp的片段。3个分离株的TAP（-）和M-MLV（-）的负对照扩增结果均为阴性。（二）转录子mRNA序列分析分离株H的5’RACE扩增产物与3’RACE巢式扩增产物拼接产生了分别为1154bp、954bp和852bp的转录子。三个转录子的5’端跨越了301bp，分别位于UL141B ORF 5’端上游-88nt，ORF内部132nt和213nt。3’端均位于UL141B ORF 3’端下游3-23nt处的PolyA信号处。分离株X的5’RACE扩增产物的序列与3’RACE巢式扩增产物拼接产生了一个长度为1223bp的转录子。5’端位于UL141B ORF 5’端上游-165nt，3’端位于UL141B ORF 3’端下游3-23nt处的PolyA信号处。分离株CH的5’RACE扩增产物的序列与3’RACE巢式扩增产物拼接产生了一个长度为1969bp的转录子。与分离株H相应区域的DNA序列对比，该片段5’末端位于UL140 ORF上游-29nt，3’端位于UL141B ORF 3’端下游3-23nt处的PolyA信号处，并且mRNA序列3’末端存在19个多聚腺苷酸结尾。未发现剪切和拼接。（三）转录子ORF的确定分离株H的三个转录子中确定的ORF长度分别为1017bp，894bp和708bp。最长的ORF与UL141B ORF一致。另外两个ORF与UL141B ORF的124nt至1017nt和310nt至1017nt同源。分离株X的转录子中确定的ORF长度为1017bp，与UL141B ORF一致。分离株CH的转录子中确定了两个分别与UL140基因和UL141B基因相同的ORF。（四）转录子5’非编码区的序列分析在分离株H和X中确定的所有ORF的起始密码子ATG至UL140 ORF终止子TGA之间的非编码区的DNA序列中均未发现典型的转录起始信号TATAA盒或类似的其它转录起始信号序列。三、HCMV全长cDNA文库构建（一）HCMV全长cDNA文库容量、重组律和评价1、HCMV全长cDNA文库容量1．12×106，重组率为95％。3、文库评价共随机筛选26个克隆进行5’端单向测序，去掉低质量的序列、屏蔽掉载体、去掉100bp以下的序列后还剩22条有效序列。同时对序列进行全长分析，在22条序列中有20条序列有相关同源信息，结果为其中15条全长，完整性比率为75％。（二）HCMV cDNA克隆测序经过在NCBI网站进行BLAST搜索，在22条序列中有9个序列（40．9％）在HCMV基因组中找到了同源序列。我们将以往HCMV基因转录的研究中未见报道的3条序列的克隆进行了完整测序。同源性比较发现，克隆024序列包含了HCMV Towne株中预测基因UL153的ORF（开放阅读框架）序列。与Towne株UL153 ORF克隆024序列预测的ORF 5’端比UL153 ORF向前延伸61个碱基，3’端向后延伸12个碱基。两个ORF的阅读框架没有发生移码突变。克隆021序列与HCMV AD169株中的预测基因UL87 ORF内部第1135nt至1909nt的反相互补序列同源。克隆023序列3’端的245bp的序列与HCMVAD169株中预测的UL30基因1nt至245nt同源，5’端位于预测的UL30基因上游-327nt。这两个转录子的序列与同源的DNA序列比较未发生剪切和拼接。但是，应用DNAStar软件包对这两个mRNA序列进行ORF预测，未找到可能的ORF。克隆006序列未进行完整测序。5’端的测序结果为760bp，同源分析表明它与HCMV AD169中的预测基因IRL4（TRL4）的上游的164bp序列、ORF全部序列和下游的79bp序列同源。结论1、HCMV UL141片段广泛存在于临床分离株中。2、与Cha等测序的Toledo株比较，所有临床分离株UL141基因在第227位核苷酸均缺失碱基T。预测产生两个新的ORF（UL141A，UL141B）。3、UL141A不具有转录的能力。4、UL141B ORF无论在核苷酸还是在氨基酸水平均高度保守。UL141B基因至少存在4种转录子结构。5、成功构建HCMV全长cDNA文库，获得了4个新的转录子结构，并且发现HCMV中可能存在3个的新基因。
马艳萍,阮强,何蓉,齐莹,孙峥嵘,吉耀华,黄郁晶,刘庆,陈淑荣,王继东[7]（2007）在《人巨细胞病毒UL134基因在临床低传代分离株的多态性研究》文中研究说明目的人巨细胞病毒（HCMV）呈现一定的基因多态性。病毒的致病性可能与不同分离株的基因变化有关。HCMV Toledo株和其他低传代临床分离株基因组UL/b′区中发现的19个基因（UL133-UL151）可能在病毒潜伏、复制、逃避机体免疫和不同组织细胞嗜性等方面起重要作用。该文研究HCMV不同临床分离株UL134基因及其编码蛋白氨基酸序列的多态性,分析这种多态性与人巨细胞病毒感染引起的各种疾病之间的关系,提供了HCMV基因多态性的一项基本数据。方法对荧光定量PCR方法检测HCM V-DNA阳性的32株临床低传代分离株进行UL134基因全序列PCR扩增、测序及分析。结果32株临床低传代分离株UL134基因PCR扩增均阳性。与Toledo株比较,临床分离株UL134基因核苷酸和预测编码蛋白质的氨基酸序列较保守,同源性分别为96.4%98.3%和92.7%94.9%,但预测编码蛋白质新增一个SUL位点。结论与Toledo株比较,临床分离株UL134基因比较保守,但仍具有一定的多态性,未发现UL134基因与HCMV致病性之间的本质联系。
阮强[8]（2007）在《人巨细胞病毒UL/b’区基因多态性》文中研究表明人巨细胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）在人群中普遍感染,在新生儿中,HCMV先天感染可引起黄疸性肝炎、先天性巨结肠、小头畸形等各种消化系统和神经系统畸形。导致HCMV不同致病性的发病机制还不十分清楚,一方面与宿主免疫功能,即有效的细胞及体液免疫应答有关;另一方面与病毒的数量、入侵部位及病毒自身的基因结构相关,尤其是与病毒毒力、组织嗜性和病毒逃避机体免疫攻击能力密切相关的基因关系密切。对于HCMV基因多态性的研究可以在基因层面揭示不同来源临床株的结构特点,对全面认识HCMV基因组和进一步深入研究基因组功能具有重要意义,成为HCMV研究的热点领域之一。近年来,国际多个研究小组对HCMV临床株广泛存在而旧有实验室株缺失的UL/b’区基因进行了较系统的研究,取得了较快的进展。此专题对这方面的研究进展进行概要介绍,以供同行了解与深入研究。
齐莹[9]（2007）在《人巨细胞病毒UL139、UL140、UL138基因多态性研究》文中提出人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus，HCMV）为独特的β—疱疹病毒，一旦发生感染，常终身带毒。目前HCMV感染在引起先天性宫内感染的微生物中居于首位。综合国内外研究结果，活产新生儿的先天性HCMV感染率约为0.3％—2.0％。其中有症状或明显改变的占5％，主要包括：黄疸性肝炎、先天性巨结肠、小头畸形，智力发育迟缓等；有轻微症状或非典型症状改变的占5％；其余90％HCMV感染表现为无症状感染，但其中5％-15％HCMV感染患儿多在生后两年内发生神经性耳聋或不同程度的神经精神运动障碍。目前为止，HCMV的致病机制尚不清楚。一方面与宿主的免疫功能，即有效的细胞及体液免疫有关；一方面与病毒的数量、入侵部位及病毒自身的基因结构，尤其是与病毒毒力、组织嗜性和病毒逃避机体免疫攻击能力相关的基因，也密切相关。1996年，Cha等发现HCMV低传代的Toledo株与临床分离株大约有15kb的片段（19个ORF）在实验室AD169株中不存在。它们定位于HCMV的UL／b’区，依次命名为UL133-UL151，此区为高度可变区。AD169、Towne等实验室株在细胞培养反复传代过程中出现了UL／b’区遗传信息的丢失和重排，并导致HCMV毒力和致病性的明显减弱。根据小鼠动物模型，Toledo株比实验室株复制水平至少高三倍；随后的研究发现，Toledo株和临床分离株对上皮和内皮细胞存在嗜性，而高传代的AD169株则丧失了这种能力；并且发现这15kb的片段对于病毒能够在移植人体组织的重症联合免疫缺陷（SCID）鼠中进行复制是必需的，暗示这段基因在HCMV于人体内复制过程中的重要性。目前，关于HCMV UL／b’区基因的多态性及其与发病机制的关系成为国际HCMV最活跃的研究领域。其中人们已经发现其在HCMV感染过程中发挥一定作用的基因包括UL141、UL142、UL144以及UL146、UL147。HCMV UL141基因表达产物能够下调自然杀伤细胞（NK细胞）—激活配体CD155的表达，从而介导了HCMV感染细胞有效防止自然杀伤细胞的杀伤作用。HCMV UL142基因编码的包膜糖蛋白能够下调自然杀伤细胞激活性受体（NKG2D）的配体MHCⅠ相关分子A（MICA），从而也能够有效的防止NK细胞的杀伤作用；同时UL142编码蛋白还可以抑制NK细胞的裂解。HCMV UL144编码一种Ⅰ型跨膜糖蛋白，据推测其编码产物是一种疱疹病毒穿入介子（HveA或HveM）的类似分子，HveA是肿瘤坏死因子受体超家族成员（TNFR）之一，在人类细胞和体液免疫防御中都发挥重要作用；有关UL144不同基因型是否与HCMV感染临床及预后相关尚处于争论之中。HCMV UL146、UL147基因编码产物与α-趋化因子白细胞介素（IL-8）有相同的信号肽及半胱氨酸空间位置。但到目前为止，尚未发现上述哪个基因多态性与HCMV感染致病性明确相关；这使我们推测在这个区域的其他基因是否能够在HCMV致病性方面起重要作用。HCMV UL139、UL140和UL138基因均定位于实验室株不存在的19个ORF中，目前它们编码蛋白在理论上是存在的，但其生物学功能还不清楚，少见文献报导。本文主要研究HCMV UL139、UL140和UL138基因在低传代临床分离株中的多态性，为探讨其多态性与HCMV感染不同致病性之间的关系奠定基础；同时推测其编码蛋白的生物学功能，进而为在分子水平上揭示HCMV感染的致病机制奠定基础。材料与方法一、标本来源HCMV临床分离株及4例尿标本均来自我院1988-1993年期间住院患儿，其中有黄疸患儿、小头畸形及先天性巨结肠患儿。另外3例尿标本来自门诊同年龄组无症状感染儿，均追踪至2岁无任何异常表现。所有标本于2000年进行荧光定量PCR（QPCR）测HCMV-DNA均为阳性，并排除其他病毒感染。-70℃备用。二、实验方法（一）标本处理，提取DNA1、临床分离株标本取自病毒分离实验，取分离株上清液与等体积裂解液混合，煮沸15min，离心数秒。2、尿标本取1ml尿标本，15000rpm／min离心15min，弃上清，加DNA裂解液50μl，混匀，离心数秒。100℃煮沸10min，15000rpm／min离心5min。（二）PCR扩增1、引物设计表1，PCR扩增引物2、PCR扩增反应体系为50μl：10×Buffer 5μl，dNTP混合物2.5μl（2.5mmol／L），rTaq酶2U，上下游引物各1μl（33pmol／μl），模板3.5μl，用双蒸水补至总反应体积50μl。95℃预变性4分钟；95℃变性45秒，54℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，30个循环；72℃终延伸10分钟。（三）PCR产物纯化、回收及测序将测序标本进行凝胶电泳后，切出目的DNA片段，应用Takara公司的PCR Fragment Recovery Kit回收。PCR扩增标本应用BigDye Terminators Cycle Sequencing Kit，采用ABI公司的3700型全自动DNA测序仪进行双向测序，测序由上海联合基因公司完成。（四）序列分析和提交序列分析应用软件DNAClub，BioEdit，GeneDoc，DNAStar等；用Sequin软件向GenBank提交整理后序列。结果一、HCMV UL139、UL140和UL138基因PCR扩增结果26例HCMV UL139标本以及30例UL140和UL138标本经PCR扩增后全部阳性，且测序结果理想。部分序列已被GenBank收录，序列号为No．AY21 8873-AY21 8887，AY601 874-AY601 877，AY8052552，AY805259，AY805260，AY805292，AY805294，AY905263，AY905264，AY218849-AY218859及AY255774-77，AY218860-218872，AY255772-73，AY601873，AY941163-65。二、HCMV UL139、UL140和UL138基因多态性研究（一）HCMV-UL139基因核苷酸及氨基酸序列的比较及进化树分型各临床分离株HCMV-UL139基因序列由408-444个核苷酸构成。核苷酸的变异成簇分布形成三个主要的基因型G1（G1a、G1b、G1c），G2（G2a、G2b）以及G3。G1a型与Toledo株同源性为≌100％；其他亚型与Toledo株相比，包含12-36个核苷酸的插入以及24-49个核苷酸的替换，其中47.8-60.7％是错义突变，导致广泛的氨基酸变异。HCMV UL139编码蛋白的氨基酸序列进化分析结果与核苷酸序列的进化树基本一致。以Toledo株为参考株，临床分离株（除G1a型）虽于序列的5′端存在多个核苷酸的插入，由于均为3或3N个核苷酸的插入，未造成移码突变，故3′端氨基酸序列基本相似。所有UL139编码蛋白的羧基端及8个半胱氨酸是相对保守的。（二）HCMV-UL140基因核苷酸序列及氨基酸序列的分析Toledo株和15株临床低传代分离株HCMV-UL140的ORF均由576个核苷酸构成，预测编码191个氨基酸的蛋白。测序结果显示Toledo株与各临床低传代分离株之间的HCMV-UL140核苷酸序列及氨基酸序列比较保守，变异率分别为0—3.2％及0—4.6％。DNA序列的变异分布在整个编码区，均为碱基替换，无插入及缺失。绝大部分的核苷酸为同义突变，没有引起编码氨基酸的改变；同时绝大多数的氨基酸变异为非保守替换。（三）HCMV-UL138基因核苷酸序列及氨基酸序列的分析Toledo株和19株临床低传代分离株HCMV-UL138的ORF均由510个核苷酸构成，预测编码169个氨基酸的蛋白。测序结果显示Toledo株与各临床低传代分离株之间的HCMV-UL138核苷酸序列及氨基酸序列比较保守，变异率分别为0—2.4％及0—1.8％。DNA序列的变异分布在整个编码区，均为碱基替换，无插入及缺失。绝大部分的核苷酸为同义突变，没有引起编码氨基酸的改变；同时绝大多数的氨基酸变异为非保守替换。三、HCMV UL139、UL140和UL138编码蛋白性质及功能预测（一）HCMV UL139编码蛋白性质及功能预测应用Editseq及DNASis软件进行UL139编码蛋白分子量（Mr）、等电点（pI）和二级结构的预测。UL139蛋白是一个分子量大约为14.2—15.3KD，等电点为4.94-5.64的弱酸性蛋白质。蛋白质二级结构的预测可以分为6个型，与UL139核苷酸分型相对应。我们发现所有的UL139包膜糖蛋白（gpUL139）与B淋巴细胞表面的分化抗原CD24存在一定区域的同源。HCMV临床分离株UL139基因预测的蛋白质重要功能区域，由于各株所属基因型的不同而略不同；分别包括4或5个糖基化位点（ASN，N-glycosylation site）位点，2-4个N相连豆寇酰化位点（MYR，N—myristoylation site）位点，3或4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点（CKP，Casein kinase phosphorylationⅡsite）位点。上述3种重要功能区域在26份标本中均存在，而且相对保守，与Toledo株相比，没有明显改变。其中G1b型的UL139基因编码蛋白，在氨基酸位点34-44之间新增了一个独特的原核膜脂蛋白脂结合位点（Prokaryotic membrane lipoprotein lipidattachment site，ADL）重要功能位点。（二）HCMV-UL140编码蛋白性质的预测HCMV UL140编码蛋白是一个分子量约21.5KD，pI为4.73-5.04的一个酸性蛋白。蛋白二级结构预测显示，Toledo株和15株临床低传代分离株（包括黄疸、小头畸形及先天性巨结肠三种疾病类型）HCMV UL140编码蛋白的二级结构基本相同。我们预测在氨基酸位点15-25，80-90及130-150之间可能是HCMV UL140编码蛋白的亲水性区域。所有低传代临床分离株HCMV-UL140编码蛋白的重要功能位点均比较保守，包括蛋白激酶C磷酸化位点（PKC，Protein kinase C phosphorylation site）和ScAMP磷酸化位点（SPS，SulfationcAMP phosphorylation site）以及ASN、MYR和CKP位点。各临床分离株HCMV-UL140编码蛋白的重要功能位点略有不同。临床分离株1M的UL140蛋白缺失了一个CKP功能位点，增加了一个PKC功能位点；临床分离株51C，缺失了一个ASN功能位点。而分离株27C、29C、2J、39J等UL140蛋白增加了一个CKP功能位点。（三）HCMV—UL138编码蛋白性质的预测HCMV UL138编码蛋白是一个分子量约19.3kD，pI 6.84的一个弱酸性蛋白。蛋白二级结构预测显示，Toledo株和19株临床低传代分离株HCMV UL138编码蛋白的二级结构基本相同。我们预测在氨基酸位点55-65，70-90及105-115之间可能是HCMV UL138编码蛋白的亲水性区域。所有临床低传代分离株HCMV-UL138编码蛋白的重要功能位点均比较保守，包括酪氨酸激酶磷酸化位点（TKP，tyrosine kinase phosphorylation site），以及PKC、MYR、CKP和SPS位点。与Toledo株相比，无新增的重要功能基团；各临床分离株（除20M株外）缺失了一个PKC位点。四、UL139、UL140及UL138基因多态性与HCMV感染不同临床表现的关系在HCMV UL139基因中，无症状的HCMV感染患儿与有症状的患儿一样分别存在于UL139的三个基因型中。不同临床表现的HCMV感染患儿在UL139基因型中的分布没有明显不同。我们未发现不同疾病类型（黄疸、小头畸形和先天性巨结肠）的临床分离株在UL140及UL138基因中成簇分布。结论1．HCMV UL139、UL140和UL138基因广泛存在于临床低传代分离株中。2．HCMV UL139基因呈现高度多态性，是目前发现的HCMV中变异最大的基因之一，存在多个核苷酸的插入和替换（多为错义突变）。而且这些变异形成了株特异性的基因型，表明生物进化选择有助于UL139变异各型的保留，从而使UL139基因不同基因型的变异在特定的环境中可能具有更大的适应性。3．我们发现HCMV UL139编码跨膜糖蛋白与人B淋巴细胞表面的分化抗原CD24存在一定区域的同源，可能参与机体在HCMV感染后的免疫反应。4．HCMV UL140及UL138序列高度保守。
何蓉,阮强,齐莹,马艳萍,孙峥嵘,吉耀华,黄郁晶[10]（2007）在《人类巨细胞病毒编码趋化因子HCMV UL146序列在临床低传代分离株中的多态性研究》文中提出目的探讨人类巨细胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）UL146序列在临床患儿低传代分离株中的多态性及其与临床疾病的关系。方法对23株HCMV临床低传代分离株及2例同年龄组HCMV-DNA定量PCR方法检测阳性健康儿尿液进行HCMV-UL146 PCR扩增及测序分析。结果UL146序列呈现较高的多态性,UL146的序列可以分为3组,所有巨结肠患儿标本均分布在G2组,无症状感染儿均在G2B组,而α化学因子功能域在各序列中保守。结论序列的变异可能会影响UL146吸附中性粒细胞,影响病毒扩散。
二、人巨细胞病毒UL149基因在临床低传代分离株中的多态性研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人巨细胞病毒UL149基因在临床低传代分离株中的多态性研究（论文提纲范文）
（1）人巨细胞病毒UL147基因在婴儿巨细胞病毒肝炎临床株中的多态性（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 PCR扩增: |
| 1.2.2 PCR扩增阳性标本测序: |
| 1.2.3 序列分析: |
| 2 结果 |
| 2.1 扩增结果 |
| 2.2 核苷酸序列及其编码蛋白氨基酸序列的多态性 |
| 2.2.1 测序及进化树分析: |
| 2.2.2 核苷酸序列及氨基酸序列比较分析: |
| 2.3 编码蛋白重要功能位点分析 |
| 3 讨论 |
（4）gB、UL144、UL133基因在人类巨细胞病毒临床株中的多态性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 目录 |
| 第一章 前言 |
| 1.巨细胞病毒的基本特征和流行情况 |
| 1.1 巨细胞病毒生物学 |
| 1.2 HCMV感染的流行特点 |
| 2.人类巨细胞病毒的致病机制和临床症状 |
| 2.1 致病机制 |
| 2.2 临床表现 |
| 3.人巨细胞病毒gB基因研究进展 |
| 4.人巨细胞病毒UL/b'区UL144基因多态性研究进展 |
| 5.巨细胞病毒的临床分离 |
| 第二章 人类巨细胞病毒UL144基因在临床低传代株中的多态性研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 仪器设备 |
| 2.3 细胞和标本来源 |
| 2.4 MEM配制 |
| 2.5 病毒分离和扩增 |
| 2.6 病毒基因组提取 |
| 2.7 PCR扩增 |
| 2.8 片段回收 |
| 2.9 测序以及序列分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 临床病毒株 |
| 3.2 UL144遗传多态性 |
| 3.3 gB遗传多态性 |
| 3.4 gB和UL144多态性与临床结果的关系 |
| 4 讨论 |
| 第三章 人类巨细胞病毒UL33基因在临床低传代株中的多态性研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 仪器设备 |
| 2.3 细胞和标本来源 |
| 2.4 MEM配制 |
| 2.5 病毒分离和扩增 |
| 2.6 病毒基因组提取 |
| 2.7 PCR扩增 |
| 2.8 片段回收 |
| 2.9 DNA测序和遗传多态性分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 临床病毒株 |
| 3.2 临床株UL133基因序列多态性分析 |
| 3.3 UL133蛋白翻译后修饰以及结构预测 |
| 3.4 UL133基因型与患儿临床症状之间的关系 |
| 4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 缩写表 |
| 读研期间文章发表和录用情况 |
| 致谢 |
（6）人巨细胞病毒UL141基因多态性和转录子结构分析以及人巨细胞病毒全长cDNA文库构建（论文提纲范文）
| 一、摘要 |
| 中文论着摘要 |
| 英文论着摘要 |
| 二、英文缩略语 |
| 三、论文 |
| 论文一 人巨细胞病毒UL141基因多态性和转录子结构研究以及人巨细胞病毒全长cDNA文库构建 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果(附论文图片) |
| 讨论 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 论文二 HCMV全长cDNA文库构建 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果(附论文图片) |
| 讨论 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 五、参考文献 |
| 六、附录 |
| 综述 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（7）人巨细胞病毒UL134基因在临床低传代分离株的多态性研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 标本来源 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 标本处理 |
| 1.2.2 引物设计 |
| 1.2.3 PCR 扩增 |
| 1.2.4 凝胶回收 |
| 1.2.5 PCR扩增阳性标本测序 |
| 1.2.6 序列分析 |
| 1.2.7 序列提交 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 HCMV UL134基因PCR扩增结果 |
| 2.2 临床分离株HCMV UL134基因序列多态性及其编码蛋白分析 |
| 2.2.1 HCMV UL134基因核苷酸和氨基酸序列分析 |
| 2.2.2 编码蛋白质性质、二级结构及重要功能位点预测 |
| 3 讨论 |
（9）人巨细胞病毒UL139、UL140、UL138基因多态性研究（论文提纲范文）
| 一、摘要 |
| 中文论着摘要 |
| 英文论着摘要 |
| 二、英文缩略语 |
| 三、论文 |
| 前言 |
| 论文一、人巨细胞病毒 UL139基因在临床低传代分离株中的多态性研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果(附论文图片) |
| 讨论 |
| 结论 |
| 论文二、人巨细胞病毒 UL140基因在临床低传代分离株中的多态性研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果(附论文图片) |
| 讨论 |
| 结论 |
| 论文三、人巨细胞病毒 UL138基因在临床低传代分离株中的多态性研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果(附论文图片) |
| 讨论 |
| 结论 |
| 四、本研究创新性的自我评价 |
| 五、参考文献 |
| 六、附录 |
| 综述 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
四、人巨细胞病毒UL149基因在临床低传代分离株中的多态性研究（论文参考文献）
- [1]人巨细胞病毒UL147基因在婴儿巨细胞病毒肝炎临床株中的多态性[J]. 尹晓波,毛志芹,常淑婷,吉耀华,何蓉,齐莹,阮强,孙梅,马艳萍,孙峥嵘. 世界华人消化杂志, 2012(04)
- [2]人巨细胞病毒UL143基因在临床低传代分离株中的多态性研究[J]. 何蓉,阮强,齐莹,马艳萍,吉耀华. 中华微生物学和免疫学杂志, 2009(06)
- [3]黄疸患儿感染的人巨细胞病毒UL149基因编码产物结合多肽的氨基酸序列分析[J]. 王岳平,阮强,吉耀华,孙峥嵘,何蓉,齐莹,马艳萍. 世界华人消化杂志, 2009(12)
- [4]gB、UL144、UL133基因在人类巨细胞病毒临床株中的多态性研究[D]. 扶星星. 湖南师范大学, 2009(08)
- [5]人巨细胞病毒UL150基因在临床低传代分离株中的多态性研究[J]. 吉耀华,阮强,何蓉,齐莹,马艳萍,孙峥嵘,刘庆,王继东. 中华实验和临床病毒学杂志, 2008(04)
- [6]人巨细胞病毒UL141基因多态性和转录子结构分析以及人巨细胞病毒全长cDNA文库构建[D]. 马艳萍. 中国医科大学, 2008(09)
- [7]人巨细胞病毒UL134基因在临床低传代分离株的多态性研究[J]. 马艳萍,阮强,何蓉,齐莹,孙峥嵘,吉耀华,黄郁晶,刘庆,陈淑荣,王继东. 中国当代儿科杂志, 2007(06)
- [8]人巨细胞病毒UL/b’区基因多态性[J]. 阮强. 临床儿科杂志, 2007(07)
- [9]人巨细胞病毒UL139、UL140、UL138基因多态性研究[D]. 齐莹. 中国医科大学, 2007(05)
- [10]人类巨细胞病毒编码趋化因子HCMV UL146序列在临床低传代分离株中的多态性研究[J]. 何蓉,阮强,齐莹,马艳萍,孙峥嵘,吉耀华,黄郁晶. 中华微生物学和免疫学杂志, 2007(01)