利用猪全基因组CRISPR/Cas9敲除文库筛选猪流感病毒复制必需宿主基因

论文摘要

猪流感（Swine influenza,SI）是由猪流感病毒（Swine influenza virus,SIV）引起的猪的一种呼吸道传染病,其发病率可高达100%。猪流感常常继发于猪繁殖与呼吸综合征、支原体肺炎、圆环病等,之后会引起免疫损伤,进而延长呼吸道疾病的病程,提高死亡率。因此,在规模化养猪场中,猪流感普遍存在且难以根除,对生猪养殖产业具有重大威胁。A型流感是一种重要的人畜共患病,而猪又是禽、猪、人流感病毒共同的易感宿主,是流感病毒基因重组或重配的“混合器”以及产生流感病毒新流行毒株的“孵育器”,因此猪感染流感病毒后使病毒极易发生跨种传播。基于猪流感在我国乃至世界范围内对生猪健康高效养殖以及公共卫生产生的重大威胁,预防和控制猪流感病毒的流行具有至关重要的意义。本研究利用已有的猪肾细胞CRISPR/Cas9全基因组敲除文库（PK-15-GeCKO）筛选当前较为流行的欧亚禽系猪流感病毒复制必需的宿主基因。并在稳定表达Cas9蛋白的PK-15细胞系（PK-15-Cas9）上单个敲低筛选到的某些基因的表达,初步验证敲低该基因后抗流感病毒效果。同时为了更接近自然感染状态,选择新生猪气管上皮（newborn pig trachea epithelial,NPTr）细胞系为细胞模型构建全基因组敲除文库,因此本研究构建了稳定表达Cas9蛋白的NPTr细胞系（NPTr-Cas9-Blast）。本研究为筛选SIV复制必需宿主基因奠定基础,为培育抗SIV感染的基因编辑猪提供理论依据。主要研究内容如下:1 SIV感染PK-15-GeCKO筛选病毒复制必需宿主基因在感染SIV 96 h后,对照组细胞（PK-15-Cas9）全部死亡,测定对照组和实验组（PK-15-GeCKO）病毒血凝价,将存活细胞扩大后进行下一轮感染。四轮感染筛选后,实验组细胞几乎全部存活,且病毒几乎不再增殖。对二、三、四轮筛选后的存活细胞进行高通量测序,对筛选到的基因进行基因本体论（Gene Ontology,GO）分析、京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路分析等生物信息学分析,表明在猪全基因组范围内筛选到了SIV感染猪所必需宿主基因的候选基因,且这些基因表达的蛋白涉及多个生物学过程、细胞组分和分子功能等。2初步验证候选基因的对病毒增殖的影响根据筛选结果选择其中富集程度较高的5个基因的sgRNA,通过慢病毒感染的方式将sgRNA分别整合至PK-15-Cas9中,对获得的多克隆基因敲除细胞系的抗病毒效应进行初步验证,在多克隆基因敲除细胞系上感染SIV,分别于12、24和36 h收取上清测定病毒滴度。为了确定这些基因的敲低是否特异地影响了猪流感病毒的增殖,在基因敲除细胞系上感染了人源流感病毒,于36 h取上清测定病毒滴度,发现SLC、R6、GG和AD等4个基因的敲低对猪流感和人流感病毒在猪的细胞上具有不同程度的抑制作用,可进行进一步的功能验证。3构建稳定表达Cas9蛋白的NPTr细胞系考虑到流感病毒首先攻击的是呼吸道器官,因此选择NPTr细胞为模型进行二次筛选。在本研究中构建了稳定表达Cas9蛋白的NPTr细胞系（NPTr-Cas9-Blast）:首先摸索了合适的慢病毒包装条件以及慢病毒感染条件,在293T细胞上包装了携带Cas9蛋白的慢病毒,并感染至野生型NPTr细胞中,利用有限稀释法纯化细胞系,之后将已知具有敲除活性的靶向内源性基因ANPEP的sgRNA通过慢病毒感染的方式整合至候选细胞系中,根据T7E1酶切检测和测序结果选择Cas9敲除活性最高的细胞系确定为用于构建全基因组敲除文库的NPTr-Cas9-Blast。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表（Abbreviation）
• 1 文献综述
•   1.1 猪流感
•     1.1.1 流感病毒的结构
•     1.1.2 流感病毒基因组及其表达产物
•     1.1.3 流感病毒的生命周期
•     1.1.4 影响流感病毒增殖的因素
•       1.1.4.1 病毒蛋白对流感病毒的影响
•       1.1.4.2 宿主蛋白对流感病毒的影响
•     1.1.5 流感病毒相关宿主基因组学研究进展
•     1.1.6 猪流感流行病学
•       1.1.6.1 猪流感与人源流感
•       1.1.6.2 猪流感与禽源流感
•     1.1.7 猪流感病毒的危害
•   1.2 CRISPR/Cas9 系统
•     1.2.1 CRISPR/Cas9 简介
•     1.2.2 CRISPR/Cas9 的应用
• 2 目的意义
• 3 材料和方法
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 细胞和毒株与鸡胚
•     3.1.2 菌株与质粒
•     3.1.3 抗体
•     3.1.4 引物及sgRNA
•     3.1.5 主要酶、试剂及试剂盒
•     3.1.6 主要培养基及其配制
•     3.1.7 相关试剂及配制
•     3.1.8 主要仪器设备
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 细胞相关实验
•       3.2.1.1 细胞复苏
•       3.2.1.2 细胞冻存
•       3.2.1.3 细胞计数
•       3.2.1.4 细胞转染
•       3.2.1.5 细胞活力测定
•     3.2.2 病毒相关实验
•       3.2.2.1 流感病毒的增殖
•       3.2.2.2 流感病毒的细胞接种
•       3.2.2.3 流感病毒血凝价的测定
•       3.2.2.4 TCID50 的测定
•     3.2.3 Western Blot蛋白表达检测实验
•       3.2.3.1 细胞总蛋白的提取及样品制备
•       3.2.3.2 SDS-PAGE电泳
•       3.2.3.3 蛋白质转膜
•       3.2.3.4Western Blot实验
•     3.2.4 高通量测序样品制备
•       3.2.4.1 高通量提取细胞基因组DNA
•       3.2.4.2 PCR扩增含有g RNA片段
•       3.2.4.3 高通量PCR纯化
•     3.2.5 Cas9-Blast稳转细胞系构建
•       3.2.5.1 包装携带lentiCas9-Blast的慢病毒
•       3.2.5.2 慢病毒感染及阳性细胞初筛
•       3.2.5.3 有限稀释法细胞克隆纯化
•       3.2.5.4 Cas9 稳转细胞系初筛
•       3.2.5.5 Cas9 蛋白切割效率检测
•     3.2.6 单基因敲除细胞系构建
•       3.2.6.1 sgRNA重组质粒构建
•       3.2.6.2 包装携带sgRNA重组质粒的慢病毒
•       3.2.6.3 慢病毒感染及阳性细胞初筛
•       3.2.6.4 基因敲除效率检测
• 4 结果分析
•   4.1 利用猪全基因组CRISPR/Cas9 敲除文库筛选猪流感病毒复制必需宿主基因
•     4.1.1 猪流感病毒感染文库细胞后筛选存活细胞
•     4.1.2 高通量测序及结果分析
•   4.2 候选基因单基因敲除多克隆细胞系的构建
•   4.3 单基因敲除对猪流感病毒增殖的影响
•   4.4 单基因敲除对人流感病毒增殖的影响
•   4.5 稳定表达Cas9 蛋白的NPTr细胞系的构建
•     4.5.1 三质粒慢病毒包装系统效率的确定
•     4.5.2 NPTr细胞慢病毒亲嗜性的确定
•     4.5.3 Blasticidin S、Puromycin杀死NPTr细胞最小浓度的测定
•     4.5.4 LentiCas9-Blast慢病毒包装及感染
•     4.5.5 NPTr-Cas9-Blast细胞系的纯化
•     4.5.6 具有Cas9 活性NPTr单克隆细胞系的初筛
•     4.5.7 NPTr-Cas9-Blast细胞系切割效率的验证和确定
• 5 讨论
• 6 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 肖榕

导师: 周红波

关键词: 猪流感病毒,宿主基因,病毒复制

来源: 华中农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 华中农业大学

分类号: S852.651

DOI: 10.27158/d.cnki.ghznu.2019.000584

总页数: 84

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