Piezo基因敲除载体与抗ToMV病毒载体的构建及转化农杆菌

论文摘要

植物中存在Piezo基因,而且与动物中该基因同源性较高,推测其编码蛋白的功能也应与压力有关,但是目前该基因在植物上的功能尚无任何报道。因此,本文利用TRIzol法提取番茄幼嫩果实的总RNA,PCR扩增番茄Piezo基因片段,利用在线工具寻找靶点,通过Overlapping PCR技术以pYLsgRNA-AtU3b-LacZ质粒为模板构建完整的sgRNA表达盒片段,采用“金门”克隆法将sgRNA表达盒克隆到PYLCRISPR/CAS9Pubi-N表达载体上,构建Piezo基因敲除载体,并成功转化农杆菌,旨在探讨Piezo基因在植物上的功能。番茄花叶病毒（Tomato mosaic virus,ToMV）是一类世界性分布的植物病毒,西红柿是其主要寄主,侵染西红柿后使栽培面积大幅下降造成农业重大经济损失。最近研究发现CRISPR/Cas13a系统是一种能够靶向和切割基因组单链RNA（ssRNA）分子的2类VI-A型核糖核酸酶,可被开发利用到抗植物RNA病毒研究中。本研究根据西红柿密码子偏好性合成高GC含量的Cas13a,以PYLCRISPR/CAS9Pubi-N质粒为模板扩增Pubi启动子和NOS终止子并将三者连接构建Cas13a表达体系片段;设计并合成靶向ToMV病毒的4个不同区域位点crRNA片段,以pYLsgRNA-AtU3b-LacZ质粒为模板扩增U3启动子及其终止子与crRNA片段连接构建crRNA表达片段,把Cas13a表达体系片段和crRNA表达片段与PYLCRISPR/CAS9Pubi-N骨架片段融合成一个质粒,并成功转化到农杆菌中,为Cas13a介导的西红柿抗病毒研究做基础。综上所述,本研究利用CRISPR/Cas9系统成功构建了Piezo基因敲除载体;利用CRISPR/Cas13a系统成功构建了西红柿抗ToMV病毒载体。这些结果为研究Piezo基因在植物中的功能以及减少西红柿ToMV病毒提供有价值的帮助。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
•   1.1 基因组编辑技术
•     1.1.1 基因组编辑技术概述
•     1.1.2 基因组编辑技术发展历程
•     1.1.3 CRISPR/Cas与ZFN、TALEN比较
•   1.2 CRISPR/Cas系统
•     1.2.1 CRISPR/Cas系统基本结构
•     1.2.2 CRISPR/Cas系统技术原理
•   1.3 CRISPR/Cas系统在植物中的应用
•     1.3.1 CRISPR/Cas9系统在植物中应用
•       1.3.1.1 NHEJ介导的基因编辑
•       1.3.1.2 HDR介导的基因定点插入或替换
•     1.3.2 CRISPR/Cas13a系统在植物中的应用
•       1.3.2.1 Cas13a与Cas9、Cpf1比较
•       1.3.2.2 Cas13a与RNAi比较
•   1.4 研究意义及主要研究内容
•   1.5 创新点
•   1.6 技术路线
• 2 CRISPR/Cas9基因敲除载体构建
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 植物材料
•     2.1.2 实验试剂
•     2.1.3 载体和引物
•     2.1.4 常用培养基及抗生素的配制
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 番茄幼苗叶片总RNA提取
•     2.2.2 RT-PCR方法获取cDNA
•     2.2.3 PCR扩增目标番茄基因片段
•     2.2.4 sgRNA的设计
•     2.2.5 sgRNA表达盒的构建
•       2.2.5.1 PYLCRISPR/CAS9Pubi-N、pYLsgRNA-AtU3b/LacZ质粒提取
•       2.2.5.2 构建sgRNA表达盒
•       2.2.5.3 胶回收
•     2.2.6 Cas9表达载体的构建
•       2.2.6.1 Cas9质粒酶切
•       2.2.6.2 酶切后回收
•     2.2.7 CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建
•       2.2.7.1 将sgRNA表达盒克隆到PYLCRISPR/CAS9Pubi-N载体
•       2.2.7.2 连接产物转化
•       2.2.7.3 阳性重组质粒的筛选
•   2.3 实验结果与分析
•     2.3.1 番茄幼苗叶片总RNA提取
•     2.3.2 番茄Piezo基因片段扩增
•     2.3.3 载体质粒DNA的提取
•     2.3.4 基因敲除靶位点的设计与合成
•     2.3.5 Overlaping PCR构建sgRNA表达盒
•     2.3.6 Cas9表达载体构建
•     2.3.7 重组载体质粒的提取
•     2.3.8 重组质粒引物扩增鉴定
•   2.4 讨论
• 3 西红柿抗ToMV病毒载体构建
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 菌株
•     3.1.2 酶、实验试剂盒
•     3.1.3 载体和引物
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 合成西红柿密码子优化的的Cas13a
•     3.2.2 Cas13a表达体系构建
•       3.2.2.1 扩增Pubi启动子
•       3.2.2.2 扩增Cas13a
•       3.2.2.3 扩增终止子
•       3.2.2.4 Cas13a表达体系各元件连接
•     3.2.3 串联crRNA系统
•       3.2.3.1 crRNA合成
•       3.2.3.2 启动子的分析与获取
•       3.2.3.3 PCR连接
•     3.2.4 合适的植物表达体系元件
•     3.2.5 各种质粒元件整合
•       3.2.5.1 阳性克隆的鉴定
•   3.3 实验结果与分析
•     3.3.1 Pubi启动子与Cas13a的扩增
•     3.3.2 Pubi启动子与Cas13a连接片段
•     3.3.3 扩增终止子片段
•     3.3.4 构建Cas13a表达体系
•     3.3.5 扩增U3启动子与crRNA
•     3.3.6 U3启动子与crRNA片段连接
•     3.3.7 扩增合适的植物表达元件
•     3.3.8 抗病毒载体质粒
•   3.4 讨论
• 4 重组载体的转化
•   4.1 实验材料
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 农杆菌感受态细胞制备
•     4.2.2 重组质粒转化农杆菌
•     4.2.3 农杆菌转化子的筛选
•   4.3 实验结果与分析
•     4.3.1 Piezo基因敲除载体转化
•     4.3.2 西红柿抗ToMV病毒载体转化
•   4.4 讨论
• 5 结论与展望
•   5.1 结论
•     5.1.1 Piezo基因敲除载体构建
•     5.1.2 西红柿抗ToMV病毒载体构建
•     5.1.3 载体转化农杆菌
•   5.2 展望
• 参考文献
• 附录
•   附录1 文中所用引物
•   附录2 主要仪器
•   附录3 文中涉及的DNA序列
• 后记
• 攻读学位期间取得的科研成果清单

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 高艳丽

导师: 闫洪波

关键词: 基因,病毒

来源: 河北经贸大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 河北经贸大学

分类号: Q78

总页数: 64

文件大小: 1515K

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