CHO细胞培养过程中单克隆抗体碱性电荷变体的表征与优化

论文摘要

电荷异质性是抗体的一个关键质量属性,在抗体药物的研发和生产过程中被极大重视。虽然许多引发电荷变体的体外化学机制较为清楚,但在细胞培养过程中由于涉及多重因素,特别是各种培养基组分以及它们之间的相互作用,造成电荷变体形成的根本原因尚不清楚,因此,迫切地需要更多的研究来深入阐释抗体电荷变体的形成原因及相关机制。前期在CHO（Chinese hamster overy,CHO）细胞无血清培养基开发过程中发现,添加尿苷可大幅提高最大活细胞密度以及抗体的表达量。本研究在验证此结果的基础上,首先分析了尿苷的添加对抗体电荷变体、糖基化、聚体、片段化、疏水性等质量属性的影响,研究发现尿苷的加入并未改善抗体碱性电荷变体含量极高的问题。为此,进一步考察了流加培养基中添加尿苷后生产的抗体中碱性电荷变体的组成,结果发现在碱性电荷变体组成中虽然赖氨酸变体含量大幅减少,但抗体Fab（Fragment of antigen binding,Fab）区甲硫氨酸和色氨酸的氧化比例增多。通过过氧化氢和AAPH（2,2’-Azobis（2-methyl-propionamidine）dihydrochloride,AAPH）孵育实验证实,甲硫氨酸氧化和色氨酸氧化均是mAbl抗体碱性电荷变体形成的重要因素。随后,通过在细胞培养基中添加牛磺酸、柠檬酸铁铵、N-乙酰-L-半胱氨酸、水飞蓟素和硫辛酸等抗氧化剂希望降低碱性电荷变体的含量,发现牛磺酸不仅使抗体碱性电荷变体的含量降低,并提高主峰的含量,而且还使最大活细胞密度略有提高,抗体产量显著增加,同时添加牛磺酸对抗体的糖基化、聚体以及片段化等质量属性影响较小。进一步研究表明,牛磺酸使抗体碱性电荷变体减少的关键在于抗体的赖氨酸变体和氧化变体的减少,实时荧光定量PCR和无细胞孵育实验显示,牛磺酸可能通过促进碱性羧肽酶的表达使赖氨酸变体减少。胞内活性氧水平和培养液氧化还原电位的检测结果显示,牛磺酸可能是通过抑制活性氧的形成以及提高培养液的还原性来减少氧化变体的生成。本研究结果为将来调控生产过程中抗体电荷异质性的产生、提高抗体药物的产量和质量提供指导。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 符号说明
• 第一章 文献综述
•   1.1 动物细胞培养技术生产抗体概述
•   1.2 单克隆抗体药物简介
•     1.2.1 单克隆抗体的结构及生物学功能
•     1.2.2 抗体药物的发展
•   1.3 单克隆抗体的电荷异质性
•   1.4 影响电荷异质性的常见翻译后修饰
•     1.4.1 氨基酸位点氧化
•     1.4.2 赖氨酸变体
•     1.4.3 脱酰胺
•     1.4.4 脯氨酸酰胺化
•     1.4.5 其他修饰
•   1.5 细胞培养条件对抗体电荷异质性的影响
•     1.5.1 工艺参数对电荷变体的影响
•     1.5.2 培养基组分对电荷变体的影响
•   1.6 本文的研究目的、内容及意义
• 第二章 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 细胞株
•     2.1.2 培养基
•     2.1.3 实验试剂盒
•     2.1.4 实验器材
•   2.2 细胞培养及胞外孵育实验
•     2.2.1 细胞复苏及传代
•     2.2.2 流加培养
•     2.2.3 胞外孵育实验
•   2.3 分析方法
•     2.3.1 细胞密度及活率检测
•     2.3.2 氧化还原电位及活性氧检测
•     2.3.3 总RNA提取、逆转录PCR及荧光定量PCR
•     2.3.4 抗体纯化及超滤
•     2.3.5 抗体产量检测
•     2.3.6 电荷变体含量的检测及分离
•     2.3.7 肽指纹图谱分析
•     2.3.8 N-糖基化修饰检测
•     2.3.9 聚体及片段化检测
•     2.3.10 疏水性检测
•     2.3.11 木瓜蛋白酶、过氧化氢及AAPH处理
•     2.3.12 统计学分析
• 第三章 单克隆抗体碱性电荷变体的差异表征
•   3.1 引言
•   3.2 实验设计
•   3.3 结果与讨论
•     3.3.1 尿苷对细胞生长和抗体表达的影响
•     3.3.2 尿苷对抗体质量属性的影响
•     3.3.3 添加尿苷前后碱性电荷变体组成及产生位置确定
•     3.3.4 液质联用肽指纹图谱分析
•     3.3.5 甲硫氨酸和色氨酸氧化对电荷变体分布的影响
•   3.4 本章小结
• 第四章 牛磺酸对单克隆抗体电荷变体的影响
•   4.1 前言
•   4.2 实验设计
•   4.3 结果与讨论
•     4.3.1 抗氧化剂对细胞生长及抗体产量的影响
•     4.3.2 抗氧化剂对单克隆抗体电荷变体的影响
•     4.3.3 牛磺酸对细胞生长和抗体产量及电荷的影响
•     4.3.4 牛磺酸对抗体部分质量属性的影响
•   4.4 本章小结
• 第五章 牛磺酸对碱性变体影响的机制探究
•   5.1 前言
•   5.2 实验设计
•   5.3 结果与讨论
•     5.3.1 牛磺酸对细胞生长和抗体表达的影响
•     5.3.2 牛磺酸对单克隆抗体电荷的影响
•     5.3.3 牛磺酸对赖氨酸变体和氨基酸氧化的影响
•     5.3.4 牛磺酸使赖氨酸变体减少的机制初探
•     5.3.5 牛磺酸使氧化变体减少的机制初探
•   5.4 本章小结
• 第六章 全文总结与展望
•   6.1 全文总结
•   6.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘梦娟

导师: 周燕

关键词: 细胞,碱性电荷变体,牛磺酸,氧化变体,赖氨酸变体

来源: 华东理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 华东理工大学

分类号: Q813.11

总页数: 74

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