GDSL家族酯酶的分子改造研究

论文摘要

头孢类抗生素是一类广谱抗生素,其来源主要依赖于合成或半合成,一般以7-氨基头孢烷酸（7-Aminocephalosporanic acid,7-ACA）为母体。随着细菌耐药性等问题的出现,新型抗生素的开发成为必然趋势。7-ACA3碳位为乙酰基团,脱乙酰化的7-ACA（Deacetyl-7-aminocephalosporanic acid,D-7-ACA）在3碳位形成羟基,反应活性高、易受到亲核试剂的进攻,从而转化各种官能团,合成新型头孢类产品。目前,D-7-ACA的获得主要通过化学脱乙酰化处理而成,反应条件苛刻、副产物多、对环境污染大。因此,利用安全性高、环境友好、选择性强及设备投入低等优势的新型酶水解法是未来获得D-7-ACA的必然趋势。GDSL酯酶家族由Upton和Buckley在1995年命名:因其N端含有GDSL的保守序列而得名。GDSL家族酯酶广泛分布于自然界的生物体内,在植物中与植物生长发育密切相关。然而,虽然GDSL家族的酯酶在细菌中分布非常广泛,但对微生物中GDSL家族酯酶功能的研究甚少。课题组在前期研究中鉴定了两种新型微生物GDSL酯酶:Est8和EstD1,二者均对7-ACA具有脱乙酰化活性,然而活性较低。为了提高Est8和EstD1对7-ACA的脱乙酰化活性,本论文主要通过定向进化和基于蛋白三维结构的理性设计对Est8和EstD1进行分子改造,主要研究结果如下:（1）以Est8和EstD1基因为模板,通过易错PCR的方法进行突变,从固体平板中各随机挑选470个突变子,通过依赖于pH指示剂颜色变化的比色法进行高通量筛选,获得了对7-ACA脱乙酰化活性为原酶活性2.7倍的突变子Est8-G45R。（2）将酯酶Est8-G45R进行表达及纯化,对其酶学性质进行研究,结果如下:a.酯酶Est8和Est8-G45R的最适pH均为8.5,在pH 7.5-9.0的范围内均能维持50%以上的酶活,两者几乎无显著差异;在pH稳定性的测定中,酯酶Est8经pH 3.0-10.0的缓冲液处理1 h后仍能保持50%以上的活性,pH稳定性良好;而Est8-G45R经pH 7.0-10.0的缓冲液处理1 h后能保持50%以上的活性,经pH2.2-6.0的缓冲液处理1 h后只能保持不到40%的活性,突变体的pH耐受范围变小。b.酯酶Est8和Est8-G45R的最适温度分别为40℃和35℃,能维持50%以上的酶活性的温度范围分别为20-55℃和20-45℃;在37℃、50℃以及60℃耐受1 h,酯酶Est8的半衰期都大于1 h,而酯酶Est8-G45R除37℃的半衰期大于1 h,另两个温度的半衰期都小于10 min,突变子的最适温度及温度稳定性较原酶都有所下降。c.1 mM的Na+、K+、Ca2+、Al3+、Fe3+对酯酶Est8的活性几乎没有影响,而Ag3+和SDS对该酶的活性影响较大,抑制效果达30%;而Ca2+对酯酶Est8-G45R活性的抑制效果约30%,Ag3+对其影响最大,抑制效果接近50%,结果显示突变子对金属离子和化学试剂耐受较原酶下降。d.酯酶Est8对底物pNPC2的Km、Vmax和Kcat分别为3.06 mM、297.3μmol/min/mg和154.5 s-1;酯酶Est8-G45R对底物pNPC2的Km、Vmax和Kcat分别为14.44 mM、288.8μmol/min/mg和601.7 s-1,与原酶相比,突变子对底物的催化活性显著提高。（3）通过对重组酯酶Est8和EstD1蛋白结晶条件的筛选及优化,得到了符合X衍射要求的蛋白晶体,收集到分辨率为2.3?（酯酶Est8）和2.5?（酯酶EstD1）的衍射数据,解析了重组酯酶Est8和EstD1蛋白的三维结构。（4）对酯酶Est8及4个突变酯酶（Est8-G45K、Est8-G45D、Est8-G45E和Est8-G45A）对7-ACA脱乙酰化活性进行测定,测定结果发现酯酶Est8第45位点氨基酸的带电性与酶活性存在相关性,并且带正电荷效果更好。本研究解析了GDSL家族酯酶Est8和EstD1蛋白的三维结构,并通过定向进化筛选到了对7-ACA脱乙酰化活性提高的突变子Est8-G45R。基于Est8的蛋白结构,进一步解析Est8-G45R与7-ACA底物的作用机制。同时,后续对基于Est8和EstD1蛋白结构开展的理性设计,将会更好的了解二者对7-ACA具体的催化机制,拓展对此家族酶的深入了解,也为将来对GDSL家族酯酶功能的挖掘提供理论依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
•   1.1 GDSL家族水解酶
•     1.1.1 GDSL家族水解酶概述
•     1.1.2 GDSL家族水解酶的结构特征
•     1.1.3 GDSL家族水解酶的催化机制
•     1.1.4 GDSL家族水解酶的生化功能
•   1.2 7-ACA及其脱乙酰化研究进展
•     1.2.1 7-ACA概述
•     1.2.2 7-ACA的脱乙酰化方法
•       1.2.2.1 传统方法——化学裂解法
•       1.2.2.2 新型酶水解法
•     1.2.3 7-ACA脱乙酰化活性检测方法
•   1.3 蛋白分子改造
•     1.3.1 定向进化
•     1.3.2 理性设计
•   1.4 研究的目的和意义
•   1.5 研究内容
•   1.6 技术路线
• 第2章 酯酶Est8和EstD1的定向进化
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 菌株及质粒
•     2.1.2 主要仪器
•     2.1.3 主要试剂
•     2.1.4 引物合成与DNA测序
•     2.1.5 常用培养基
•     2.1.6 常用溶液
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 突变文库构建策略
•     2.2.2 Est8和EstD1的质粒提取及浓度测定
•     2.2.3 Mutant Megaprimer Synthesis及浓度测定
•     2.2.4 EZClone Reaction
•     2.2.5 突变体质粒的转化
•     2.2.6 阳性筛选子的鉴定
•     2.2.7 酯酶Est8和EstD1突变体的筛选
•       2.2.7.1 酯酶Est8和EstD1突变文库的构建
•       2.2.7.2 酯酶Est8和EstD1突变文库的表达
•       2.2.7.3 筛选对 7-ACA高脱乙酰化活性的酯酶Est8和EstD1突变子
•       2.2.7.4 筛选对 7-ACA高脱乙酰化活性的酯酶Est8和EstD1突变子经行复筛
•     2.2.8 Est8-G45R的对 7-ACA脱乙酰化的活性研究
•     2.2.9 酯酶Est8-G45R酶学性质的研究
•       2.2.9.1 酯酶Est8-G45R酶活力的测定方法
•       2.2.9.2 酯酶Est8和Est8-G45R酶学性质的研究
•   2.3 实验结果与分析
•     2.3.1 Est8和EstD1的质粒提取及浓度测定
•     2.3.2 Mutant Megaprimer Synthesis及浓度测定
•     2.3.3 EZClone Reaction
•     2.3.4 酯酶Est8和EstD1突变体的筛选
•     2.3.5 酯酶Est8和Est8-G45R对 7-ACA脱乙酰化的活性测定
•     2.3.6 酯酶Est8和Est8-G45R酶学性质的研究
•   2.4 讨论
•   2.5 本章小结
• 第3章 GDSL家族酯酶Est8和EstD1的结构解析
•   3.1 实验材料
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 GDSL家族酯酶Est8和EstD1基因的诱导表达
•     3.2.2 Est8和EstD1的纯化
•       3.2.2.1 Est8和EstD1的镍柱亲和层析纯化
•       3.2.2.2 Est8和EstD1酶液浓缩
•       3.2.2.3 Est8和EstD1凝胶层析纯化
•       3.2.2.4 Est8和EstD1的蛋白定量
•     3.2.3 晶体初筛方法：悬滴蒸汽扩散
•     3.2.4 晶体优化方法
•     3.2.5 蛋白与底物 7-ACA共结晶
•   3.3 实验结果与分析
•     3.3.1 Est8和EstD1的序列分析结果
•     3.3.2 Est8诱导表达及镍柱亲和层析纯化的结果分析
•     3.3.3 Est8凝胶层析纯化的结果分析
•     3.3.4 Est8浓缩后蛋白定量的结果分析
•     3.3.5 EstD1诱导表达及镍柱亲和层析纯化的结果分析
•     3.3.6 EstD1凝胶层析纯化的结果分析
•     3.3.7 EstD1浓缩后蛋白定量的结果分析
•     3.3.8 Est8晶体的获得
•       3.3.8.1 Est8蛋白晶体结晶初筛
•       3.3.8.2 Est8蛋白晶体优化
•     3.3.9 Est8晶体的结构解析
•       3.3.9.1 衍射用蛋白质晶体的快速冷冻
•       3.3.9.2 Ｘ射线衍射数据收集和处理
•     3.3.10 Est8的共结晶
•       3.3.10.1 Est8蛋白与底物 7-ACA的共结晶
•       3.3.10.2 Est8蛋白与底物 7-ACA及抑制剂的共结晶
•     3.3.11 EstD1晶体的获得
•       3.3.11.1 EstD1蛋白晶体结晶初筛
•     3.3.12 EstD1晶体的结构解析
•       3.3.12.1 衍射用蛋白质晶体的快速冷冻
•       3.3.12.2 Ｘ射线衍射数据收集和处理
•   3.4 讨论
•   3.5 本章小结
• 第4章 酯酶Est8和EstD1的理性设计
•   4.1 实验材料
•     4.1.1 菌株及质粒
•     4.1.2 主要仪器
•     4.1.3 主要试剂
•     4.1.4 引物合成与DNA测序
•     4.1.5 常用培养基
•     4.1.6 常用溶液
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 定点突变
•       4.2.1.1 突变引物的设计
•       4.2.1.2 PCR反应体系及扩增条件
•       4.2.1.3 转化
•       4.2.1.4 突变后阳性筛选的鉴定与检测
•       4.2.1.5 突变质粒提取及转化
•       4.2.1.6 突变子的诱导表达及纯化
•   4.3 实验结果与分析
•     4.3.1 Est8的定点突变PCR
•     4.3.2 Est8定点突变质粒的提取
•     4.3.3 Est8突变酯酶的镍柱亲和层析纯化
•     4.3.4 Est8突变酯酶对 7-ACA脱乙酰化活性测定
•   4.4 讨论
•   4.5 本章小结
• 第5章 总结、创新与展望
•   5.1 总结
•   5.2 创新
•   5.3 展望
• 参考文献
• 附录
•   附录A 本文使用缓冲液配方
•     A1 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制
•     A2 Tris-HCl缓冲液的配制
•     A3 硼砂-氢氧化钠缓冲液
•     A4 甘氨酸-氢氧化钠缓冲液
•   附录B 酯酶Est8、EstD1和Est8-G45R基因序列及氨基酸序列
•     B1 Est8的核苷酸序列
•     B2 Est8的氨基酸序列
•     B3 EstD1的核苷酸序列
•     B4 EstD1的氨基酸序列
•     B5 Est8-G45R的核苷酸序列
•     B6 Est8-G45R的氨基酸序列
•   附录C 氨基酸中英文对照及缩写表
• 攻读学位期间发表的学术论文及研究成果
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 主虎杰

导师: 丁俊美,黄遵锡

关键词: 酯酶,定向进化,蛋白结晶,理性设计

来源: 云南师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 云南师范大学

分类号: Q55;Q78

总页数: 86

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