金硒探针实时可视化检测自噬—凋亡过程中相关蛋白表达

论文摘要

细胞内不同的信号转导途径都是由一系列不同的蛋白组调控,而在各个信号通路中上游蛋白对下游蛋白的活性具有调节作用,这一过程可以将细胞外信号转变为细胞内信号,然后通过信号的级联放大、分散以及调节,最终产生一系列全面的细胞应答反应,包括激活或抑制作用。在众多的信号转导通路中,自噬作为一种持续的稳态过程,对细胞及整个生命体起着重要的稳定作用。该过程能够分解受损的细胞成分,例如受损的细胞器、错误折叠的蛋白质和某些细胞内病原体,这些成分被自噬体吞噬后降解产生的能量能够供给细胞以保持活力及维持体内平衡。对于自噬相关分子的进一步研究也将自噬与人类相关疾病紧密联系在一起。许多神经退行性疾病都可以归因于自噬功能的缺陷。例如,帕金森病、肌萎缩侧索硬化症、阿尔茨海默病等,都有可能是因为自噬功能异常,导致无法清除突变毒性蛋白的聚集物而引起。另外,在自噬与肿瘤的相关研究中发现,自噬相关的几种蛋白在一定程度上具有抑癌活性,然而,癌细胞也可能通过自噬途径来为其进一步发展提供生存机制。近年来,人们对凋亡通路的研究发现,凋亡作为一种程序性细胞死亡机制,这个过程涉及到各种蛋白酶之间的信号级联反应,并且在不同刺激下往往伴随着不同信号分子的产生,而这些信号分子会进一步调控细胞凋亡,从而清除异常细胞,达到维持自身整体动态平衡的目的。近年来,人们在对各种疾病的研究中发现,如果对病变细胞的死亡机制有进一步了解,那就可以针对其死亡机制来设计治疗方案,有效应对疾病的发生及发展。而细胞自噬和凋亡作为细胞主要的两种生理途径,涉及到大量的信号级联反应以及信号分子的交叉调控。在对两种途径的研究中,通常认为自噬是促进细胞生存的,该过程可以保护细胞免受治疗性药物的刺激,允许细胞在长时间饥饿和其他刺激下存活,然而,还有大量文献表明,在某些情况下自噬可以通过主动降解必需的细胞成分（例如过氧化氢酶,线粒体）或通过非选择性降解细胞成分来杀死细胞,使得细胞不再存活,这表明自噬可以促进死亡,其本身可能是细胞死亡的一种机制。因此,如果能在分子水平上研究细胞自噬、凋亡以及两种途径之间的关系,对整个细胞过程的了解,以及在分子水平上设计具有针对性的方法以及药物来实现疾病的治疗具有重要意义。在对这两个过程的研究中,常有一些相关标志物出现,如cathepsin B,caspase-3,ATG4B等。通过对这些相关蛋白的研究,能够进一步了解各种蛋白在通路中的作用机制。目前对于细胞通路的相关蛋白标志物研究最常用的是生物学手段,例如Western Blot,PCR等,这些研究方法操作繁琐,而且在研究中往往需要破坏细胞结构,因此很难准确检测通路中信号分子的实时变化情况。除此之外,还有一些荧光探针也被应用到信号通路的检测中,尤其是通过金硫键连接硫醇修饰的DNA或多肽序列的金纳米探针,被应用于各种信号转导通路信号分子的检测。然而,在实际应用中,生物体内含量较高的硫醇能够破坏金硫键,无法有效可视化甄别上下游信号分子的真实变化,从而影响通路信号分子检测的真实性和可靠性。因此发展一种抗干扰能力强的荧光探针对细胞自噬-凋亡过程中上下游标志物进行实时原位可视化成像检测具有重要意义。金硒键具有跟金硫键类似的性质,并且硒醇能够打断金硫键,从而在金表面形成更加稳定的金硒键,所以,通过构建金硒探针可以有效解决金硫键在生物体内不稳定的问题。本文基于Au-Se键、cathepsin B、caspase-3、ATG4B肽链等设计合成了两种能够检测自噬-凋亡过程相关蛋白的金纳米探针。具体包括以下两个方面的工作:1.基于Au-Se键,我们在金纳米粒子（Au NPs）上修饰了能特异性识别caspase-3的肽链（标记FITC）和特异性识别cathepsin B的肽链（标记5-TAMRA）,探针组装好以后,两种荧光染料的荧光被金纳米粒子猝灭,当特定蛋白酶cathepsin B和caspase-3与纳米探针孵育之后,能够分别在相应的切割位点特异性切断多肽,从而恢复之前被Au NPs猝灭的荧光。相比于金硫探针,金硒探针具有更好的抗GSH干扰能力、抗高温干扰能力。更重要的是,当乳腺癌细胞和肝癌细胞的凋亡通路被白藜芦醇诱导激活后,利用金硒键探针可以观测到上游的cathepsin B的荧光信号和下游caspase-3的荧光信号在2到4小时之间先后出现,并且荧光强度随着时间的增加而逐渐增强,而金硫键探针由于GSH等还原性物质干扰无法观测到上下游两种凋亡标志物先后出现的现象。而后将经过相同药物处理的细胞进行了Western Blot实验,实验结果与共聚焦观察结果相符,从而证明Au-Se纳米探针可以用于监测两种信号分子的上下游关系。该Au-Se纳米探针的设计和制备为实时原位研究细胞内信号转导通路中信号分子的上下游关系提供了新的策略。2.基于Au-Se键,我们利用冷冻法优化合成金硒探针,成功在Au NPs上修饰了能特异性识别caspase-3（凋亡相关蛋白）并标记了 FITC的肽链以及修饰了特异性识别ATG4B（自噬相关蛋白）并标记了 5-TAMRA的肽链,该方法不仅能够大大缩短探针制备的时间,并且能够进一步提高探针上所连接的肽链数量。在没有待测物存在时,两种荧光染料的荧光都能被Au NPs猝灭,当遇到特定蛋白酶ATG4B和caspase-3时,分别能够在相应的切割位点特异性切断肽链,从而恢复之前被Au NPs猝灭的荧光。相比于常温的制备方法,通过冷冻法制备的探针在金纳米颗粒上能够连接更多的肽链,并且大大缩短了制备时间。而金硒探针良好的抗GSH干扰能力,能够稳定存在于细胞高硫醇环境中,从而能够实时检测细胞经过不同药物处理后产生的自噬或凋亡蛋白表达情况。这种冷冻法制备的金硒纳米探针为生物检测的实际应用提供了一种新的思路和方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
•   1.1 细胞自噬与凋亡相关通路
•     1.1.1 自噬通路中相关信号分子
•     1.1.2 凋亡通路中相关信号分子
•     1.1.3 细胞内自噬与凋亡过程的相互联系
•   1.2 金纳米探针概述
•     1.2.1 金纳米探针的制备
•       1.2.1.1 金纳米颗粒的合成
•       1.2.1.2 金纳米探针的合成
•     1.2.2 金纳米探针的分类
•     1.2.3 金纳米荧光探针的应用
•   1.3 基于金硒键构建的纳米荧光探针
•     1.3.1 金硒键的性质
•     1.3.2 金硒键纳米荧光探针在细胞分子检测中的应用
•   1.4 本论文的选题背景和研究意义
•   参考文献
• 第二章 通过金硒探针实时原位甄别凋亡通路中上下游信号分子应答关系
•   2.1 引言
•   2.2 实验部分
•     2.2.1 试剂与仪器
•     2.2.2 实验方法
•   2.3 结果与讨论
•     2.3.1 探针的合成及表征
•     2.3.2 稳定性实验
•     2.3.3 纳米探针的化学体系研究
•     2.3.4 MTT实验
•     2.3.5 细胞摄取机制研究
•     2.3.6 生物硫醇的影响分析
•     2.3.7 细胞凋亡通路的研究
•   2.4 结论
•   参考文献
• 第三章 基于冷冻法制备金硒探针用于自噬-凋亡相关蛋白的检测
•   3.1 引言
•   3.2 实验部分
•     3.2.1 试剂与仪器
•     3.2.2 实验方法
•   3.3 结果与讨论
•     3.3.1 探针的合成与表征
•     3.3.2 纳米探针的化学体系研究
•     3.3.3 MTT实验
•     3.3.4 雷帕霉素对自噬-凋亡蛋白的影响
•     3.3.5 不同药物对自噬-凋亡蛋白的成像实验
•   3.4 阶段性结论与建议
•   参考文献
• 作者发表的学术论文、专利及参与的课题
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李佳

导师: 李娜

关键词: 细胞通路,自噬,细胞凋亡,荧光纳米探针,金硒键

来源: 山东师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,化学

单位: 山东师范大学

分类号: O657.3;Q25

DOI: 10.27280/d.cnki.gsdsu.2019.000017

总页数: 87

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