类钙调蛋白亚家族基因（NbrgsCaMs）在本氏烟发育和应激胁迫中的表达及作用

论文摘要

类钙调蛋白（Calmodulin-like protein,CML）作为一类钙离子传感器,在植物应对非生物和生物应激反应中起着重要的调节作用。Rgs Ca M是CML的一个独特分支,因在烟草中作为基因沉默调控因子（Regulator of gene silencing）而被知。CML37、CML38和CML39是拟南芥Atrgs Ca Ms家族的三个成员,因此我们认为本氏烟中可能有几种Nbrgs Ca Ms,同Atrgs Ca Ms一样,能够响应不同的环境和生长发育刺激。为了进一步了解rgs Ca M在植物生长发育和环境胁迫中的调节作用,进行了以下研究。1 Rgs Ca M家族基因的序列分析:通过检索本氏烟（Nicotiana benthamiana）全基因组序列,我们得到7个同系物,并根据同系物序列比对的结果依次命名为rgs Ca M1-7。对这7个含基因保守结构域（EF-hand）的Rgs Ca M家族进行氨基酸序列比对分析并构建系统发生树,发现其中有5个是真正的Nbrgs Ca M编码序列,另外两条序列可能是伪基因或功能未知蛋白。因此我们选定rgs Ca M1、3、4（rgs Ca M4是以前报道的Nbrgs Ca M）,5和7作为研究目标,来阐明N.benthamiana中rgs Ca M家族基因的特征。通过氨基酸序列比对和系统进化树分析发现Nbrgs Ca Ms编码序列具有70.4%到93.3%的相似性;氨基酸序列具有60.2%到83.2%的同源性。2 Rgs Ca M家族启动子的活性分析:基于β-葡糖醛酸酶（β-glucuronidase,GUS）报告系统,我们构建了嵌合型rgs Ca M启动子（rgs Ca Mp::GUS）。依据GUS染色强弱和RT-q PCR检测GUS基因转录水平的高低,来反映转基因本氏烟不同发育阶段和特定应激处理下Nbrgs Ca M家族启动子活性的强弱情况。结果显示,每个Nbrgs Ca Mp驱动一个重叠但特定的GUS表达模式。Nbrgs Ca Mps主要在幼苗和成熟植株的叶脉和根组织中表达,Nbrgs Ca Mp4是Nbrgs Ca Mps中最活跃的一个。同时,Nbrgs Ca Mps编码序列之间相似度较高,且序列中预测到包含许多功能相同的增强子调控元件,因此,我们认为植物体内Nbrgs Ca Ms很可能具有重叠表达和功能补偿的作用模式,来共同调控植株生长发育和应对环境刺激。3 病毒侵染下NbrgsCaMp4表达活性分析:对NbrgsCaMp4::GUS接种TYLCCNV-A,TYLCCNV-A+β,PVX,PVX+β,TMV的系统叶片进行GUS染色,Nbrgs Ca Mp4::GUS对植株破坏性较大的TMV病毒的响应最强,其次对植株发病后期βC1复合侵染组（TYLCCNV-A+β,PVX+β）的响应。GUS染色和RT-q PCR分析发现,TYLCCNV的侵染早期,单接TYLCCNV A组和βC1复合侵染（TYLCCNV-A+β）组并未表现出启动子活性差异。TYLCCNV的侵染后期,TYLCCNV A+β处理组表现出了较高的启动子活性。TYLCCNV A单独侵染N.benthamiana时,不能引起可见的表型,而βC1作为病原致病因子,是造成植株,曲叶、脉凸的根本原因。因此我们认为βC1可能通过毒性破坏作用诱导Nbrgs Ca M4的表达。4 NbrgsCaM4的表达水平差异分析:TYLCCNV A+β侵染野生型和转基因植株在发病前期Nbrgs Ca M4表达水平与单接TYLCCNV A组无明显差异。野生型植株与转基因植株TYLCCNV A+β组发病后期Nbrgs Ca M4表达水平却高于单接TYLCCNV A组。同时,βC1转基因N.benthamiana中Nbrgs Ca M4的表达水平,无论是在幼苗植株,还是成熟植株中,均高于野生型植株2-3倍,可见βC1诱导提高了Nbrgs Ca M4基因的表达。通过接种不含病毒的缓冲液,对植株施加机械损伤,Nbrgs Ca Mp4对损伤应激反应表现出表达含量几十倍上升。此外,植株的叶龄、年龄也影响Nbrgs Ca M4的表达,老叶中表达含量高于嫩叶几十倍,成熟植株中的表达含量高于幼苗中几十倍。因此,Nbrgs Ca M4作为CML亚家族的一员,除了可在植株一般发育阶段所诱导外,不同程度的植株损伤胁迫效应（盐、干旱、机械损伤、病毒侵染类型）会导致Nbrgs Ca Mps活动的多样性。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 英文缩略表
• 第一章 引言
•   1.1 植物体内的钙离子调节蛋白
•     1.1.1 钙离子调节蛋白分类及结构特性
•     1.1.2 钙离子调节蛋白的功能特性
•   1.2 钙调素类似蛋白（CMLS）对植物生长发育的调控
•   1.3 钙调素类似蛋白（CMLS）应对环境胁迫的响应
•     1.3.1 CMLs对高盐、干旱的响应
•     1.3.2 CMLs对植物机械损伤的响应
•     1.3.3 类钙调蛋白对生物胁迫（细菌、真菌、病毒）的响应
•     1.3.4 双生病毒及其伴随卫星分子DNAβ
•     1.3.5 马铃薯X病毒（PVX）与烟草花叶病毒（TMV）病毒
•   1.4 本氏烟钙调素类似蛋白（CMLS）是一类基因沉默抑制子
•   1.5 GUS报告系统在植物基因功能研究中的应用
• 第二章 实验方法
•   2.1 DNA克隆技术
•     2.1.1 PCR扩增
•     2.1.2 纯化PCR产物
•     2.1.3 制备感受态细胞
•     2.1.4 菌落PCR阳性克隆鉴定
•     2.1.5 重复质粒的提取（碱法大提质粒）
•     2.1.6 载体酶切
•     2.1.7 载体连接与转化（片段长度以1kb为例）
•   2.2 植物小量抽提植物总DNA（CTAB法）
•   2.3 植物总RNA小量提取、RT-PCR及 RT-q PCR
•   2.4 农杆菌介导的本氏烟接种及拟南芥花序浸染
•     2.4.1 根癌农杆菌感受态细胞的制备
•     2.4.2 农杆菌感受态的电击转化
•     2.4.3 农杆菌介导的拟南芥转化（花序浸润法）
•     2.4.4 农杆菌的浸润本氏烟及接种
•   2.5 化学组织染色
•     2.5.1 GUS化学组织染色
•     2.5.2 DAB化学组织染色
• 第三章 本氏烟中类钙调蛋白家族分析及参与调控植物生长发育的研究
•   3.1 材料与方法
•     3.1.1 材料
•     3.1.2 NbrgsCaM:GUS启动子载体构建
•     3.1.3 AtrgsCaM:GUS启动子载体构建
•     3.1.4 阳性转基因幼苗的筛选
•   3.2 结果与分析
•     3.2.1 NbrgsCaMs的家族基因序列分析
•     3.2.2 AtrgsCaMps启动子的家族基因功能元件分析
•     3.2.3 NbrgsCaMps启动子的家族基因功能元件分析
•     3.2.4 NbrgsCaMp::GUS在本氏烟生长发育过程中的组织化学染色及RT-qPCR分析
•     3.2.5 AtrgsCaMp::GUS（CML37,CML38,CML39）在拟南芥生长发育过程中的组织化学染色
•   3.3 讨论
• 第四章 植物响应盐干旱胁迫的研究
•   4.1 材料与方法
•     4.1.1 材料
•     4.1.2 转基因幼苗的胁迫处理
•   4.2 结果与分析
•     4.2.1 NbrgsCaMps本氏烟植株响应盐胁迫刺激
•     4.2.2 NbrgsCaMps本氏烟植株响应干旱胁迫刺激
•     4.2.3 AtRgsCaMps拟南芥植株响应盐、干旱胁迫刺激
•   4.3 讨论
• 第五章 病毒侵染对rgsCaMps启动子活性的影响
•   5.1 材料与方法
•   5.2 结果
•     5.2.1 TYLCCNV对 NbrgsCaMps启动子活性的影响
•     5.2.2 PVX、TMV对 NbrgsCaMps启动子活性的影响
•     5.2.3 βC1 转基因N.benthamiana中 rgsCaMps启动子活性分析
•     5.2.4 机械损伤对NbrgsCaMps活性的影响
•   5.3 讨论
•     5.3.1 βC1 可能通过毒性破坏作用诱导NbrgsCaM4 的表达。
•     5.3.2 NbrgsCaMs功能重叠表达补偿模式
• 第六章 全文结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘丹丹

导师: 杨秋颖,周雪平

关键词: 类钙调蛋白,报告系统,蛋白

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 中国农业科学院

分类号: Q945

总页数: 82

文件大小: 2991K

下载量: 111