禽呼肠孤病毒σA蛋白与宿主蛋白HSP70、HSP40和RPL4相互作用的初步研究

论文摘要

禽呼肠孤病毒（Avian reovius,ARV）属于正呼肠孤病毒科（Reoviridae）,正呼肠孤病毒属（Orthoreovirus）。ARV感染鸡引起的主要病症有鸡的病毒性关节炎、腱鞘炎及矮小综合征等,除导致死亡和生产性能下降之外,该病还可诱发免疫抑制,导致机体对疫苗的免疫应答和多种病原体的抵抗能力显著降低。由此可见,ARV感染对养禽业的危害极大,给养禽业者造成了巨大的经济损失。ARV是一种不含囊膜的双链RNA病毒,其基因组由10个RNA基因片段组成,可以编码病毒的八种结构蛋白（λA、λB、λC、μA、μB、σA、σB和σC）及四种非结构蛋白（μNS、σNS、p10和p17）。其中,σA蛋白是由S2基因编码,介于外衣壳μBC蛋白和内衣壳λA蛋白之间的结构蛋白,它能够促进ARV内、外层衣壳结构的稳定。σA蛋白可以通过与dsRNA序列相结合的方式来抑制蛋白酶的活化过程,从而抑制细胞内干扰素的分泌,协助病毒粒子躲避宿主细胞内的免疫防御;在病毒侵染的过程中,σA蛋白可以通过其水解酶的活性作用作为病毒转录和复制的能量来源;σA蛋白还可以对宿主细胞内的信号通路进行调节,促进病毒在宿主细胞内的感染复制;此外,该蛋白在病毒粒子的装配过程中也承担着重要角色。在被病毒侵染的细胞中,病毒编码的蛋白和宿主蛋白之间存在着一定的联系,从而影响着病毒的感染致病过程,因此,开展ARVσA蛋白及其互作蛋白的研究对探讨ARV的致病机理具有十分重要的意义。HSP70、HSP40、RPL4蛋白均是宿主细胞内高度保守且具有重要生物学作用的蛋白。HSP70和HSP40蛋白具有分子伴侣的功能,目前对这两种蛋白与病毒蛋白的相互作用研究较多,已知猪源HSP70和人源HSP40蛋白可以在病毒入侵的过程中保证蛋白质的正确折叠和组装,促进病毒在体内的复制和增殖;而RPL4蛋白可以参与核糖体的装配过程,且禽源RPL4蛋白可以参与病毒的入侵过程。本实验室前期通过蛋白组学和酵母双杂交研究发现禽源HSP70、HSP40和RPL4蛋白与ARVσA蛋白存在一定联系,因此本研究选取这三个蛋白作为研究与ARVσA蛋白相互作用的宿主蛋白。本研究构建了pEF1α-HA-σA、pEF1α-Myc-HSP70、pEF1α-Myc-HSP40（DNAJB6）、pEF1α-Myc-RPL4真核表达重组质粒,并对所构建的真核表达重组质粒进行菌落PCR验证、双酶切验证和测序验证,结果显示,pEF1α-HA-σA、pEF1α-Myc-HSP70、pEF1α-Myc-HSP40（DNAJB6）、pEF1α-Myc-RPL4真核表达重组质粒构建成功。将所构建的真核表达重组质粒转染到人胚肾细胞（HEK293T）中进行蛋白的表达,并通过间接免疫荧光和Western blot试验对所表达的目的蛋白进行验证,结果表明:HA-σA、Myc-HSP70、Myc-HSP40（DNAJB6）、Myc-RPL4融合蛋白均可在HEK293T细胞中正确表达。将构建的pEF1α-HA-σA真核表达重组质粒分别和pEF1α-Myc-HSP70、pEF1α-Myc-HSP40（DNAJB6）、pEF1α-Myc-RPL4真核表达重组质粒在HEK293T细胞中共同表达目的蛋白,并通过免疫共沉淀试验验证病毒蛋白与所选宿主蛋白的相互作用,免疫共沉淀的结果显示:ARVσA蛋白与禽源HSP70和RPL4蛋白的相互作用结果为阴性,ARVσA蛋白与禽源HSP40（DNAJB6）蛋白有单向互作的阳性条带,即以兔源HA标签抗体为一抗进行免疫共沉淀,以鼠源Myc标签抗体为一抗进行Western blot检测有阳性条带,但反向免疫共沉淀试验条带不够明显。本研究推测ARVσA蛋白与禽源HSP40（DNAJB6）蛋白存在相互作用的关系,对此还需进行更进一步的研究。本研究为进一步探讨ARV的致病机理创造了条件。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略词表
• 第一章 文献综述
•   1.1 禽呼肠孤病毒简介
•     1.1.1 禽呼肠孤病毒的基本特征
•     1.1.2 禽呼肠孤病毒病毒的结构特征
•     1.1.3 禽呼肠孤病毒的复制
•     1.1.4 禽呼肠孤病毒的研究进展
•     1.1.5 禽呼肠孤病毒主要蛋白的简介
•   1.2 热休克蛋白及其与病毒相互作用的研究进展
•     1.2.1 热休克蛋白HSP70及其与病毒相互作用的研究进展
•     1.2.2 热休克蛋白HSP40及其与病毒相互作用的研究进展
•   1.3 核糖体蛋白L4（RPL4）及其与病毒相互作用的研究进展
•   1.4 免疫共沉淀技术在蛋白质研究中的应用
•   1.5 本研究的目的意义
• 第二章 禽呼肠孤病毒σA基因和禽源HSP70、HSP40、RPL4基因真核表达重组质粒的构建
•   2.1 材料
•     2.1.1 主要试验试剂
•     2.1.2 主要试验仪器
•     2.1.3 主要试验试剂的配置
•     2.1.4 引物
•   2.2 试验方法
•     2.2.1 pMD-18T-HSP70、pMD-18T-HSP40（DNAJB6）、pMD-18T-RPL4重组载体的构建
•     2.2.2 pMD-18T-σA重组载体的构建
•     2.2.3 pEF1α-HA-σA、pEF1α-Myc-HSP70、pEF1-Myc-HSP40（DNAJB6）、pEF1α-Myc-RPL4真核表达重组质粒的构建
•   2.3 试验结果
•     2.3.1 目的基因的PCR扩增结果
•     2.3.2 目的基因连接pMD-18T的阳性克隆筛选结果
•     2.3.3 真核表达重组质粒的阳性克隆筛选结果
•     2.3.4 真核表达重组质粒的双酶切验证结果
•   2.4 分析与讨论
• 第三章 禽呼肠孤病毒σA基因和禽源HSP70、HSP40、RPL4蛋白的表达和验证
•   3.1 材料
•     3.1.1 试验材料
•     3.1.2 主要试验试剂
•     3.1.3 主要试验仪器
•     3.1.4 主要试验试剂的配置
•   3.2 试验方法
•     3.2.1 IFA验证目的蛋白的表达
•     3.2.2 Western blot验证目的蛋白的表达
•   3.3 试验结果
•     3.3.1 间接免疫荧光检测目的蛋白的表达结果
•     3.3.2 Western blot检测目的蛋白的表达结果
•   3.4 分析与讨论
• 第四章 禽呼肠孤病毒σA基因和禽源HSP70、HSP40、RPL4蛋白相互作用的验证
•   4.1 材料
•     4.1.1 主要试验试剂
•     4.1.2 主要试验仪器
•     4.1.3 主要试验试剂的配置
•   4.2 试验方法
•     4.2.1 免疫共沉淀（Co-IP）
•     4.2.2 Western blot检测蛋白的相互作用
•   4.3 试验结果
•   4.4 分析与讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 任红玉

导师: 谢芝勋

关键词: 禽呼肠孤病毒,蛋白,蛋白表达,相互作用,免疫共沉淀,蛋白印迹

来源: 广西大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 广西大学

分类号: S852.65

总页数: 66

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