拟南芥谷氨酸受体AtGLR3.4的单分子动力学研究

论文摘要

谷氨酸受体（glutamate receptor）在植物的生长发育、代谢调节以及信号传导等方面发挥着重要的调控作用。AtGLRs属于拟南芥的谷氨酸受体家族,类似于动物中的iGluRs。拟南芥谷氨酸受体有三个亚族,AtGLR3.4属于第三个亚族。AtGLR3.4可以通过Ca2+信号机制,快速响应机械胁迫和冷胁迫等外界刺激,从而响应外界环境信号。然而,过去对AtGLR3.4的研究大多采用体外实验,不能实现活细胞中AtGLR3.4的原位检测。除此之外,前人对植物AtGLR3.4在质膜上的时空分布动态关注较少,并且对响应逆境胁迫早期事件的研究尚不清楚。本研究运用可变角度全内反射荧光显微术（variable angle-total internal reflection fluorescence microscopy,VA-TIRFM）和激光扫描共聚焦显微术（laser scanning confocal microscopy,LSCM）等技术,并结合生化技术和细胞生物学方法,对配体处理后,拟南芥幼苗AtGLR3.4蛋白在细胞膜上的动力学行为,以及影响AtGLR3.4蛋白动力学的因素进行了比较深入的研究。主要结果如下:（1）通过Glu、GABA和GSH处理拟南芥幼苗,对幼苗的根表型进行观察和分析,发现不同配体Glu、GABA和GSH处理后根长变短。（2）运用VA-TIRFM技术,观察拟南芥幼苗叶表皮细胞AtGLR3.4动态特征,结果显示:AtGLR3.4在质膜上分布不均匀;通过MATLAB软件分析后发现,AtGLR3.4存在四种运动模式,其中定向运动最多,约占55%;寡聚化状态分析发现,AtGLR3.4以四聚体形式存在,然而不能排除存在单体、二聚体以及三聚体。不同配体处理后,AtGLR3.4蛋白动力学特征发生了变化:Glu、GABA处理后,AtGLR3.4蛋白扩散范围、扩散系数、运动速率、停留时间都增加:不同浓度GSH处理后,AtGLR3.4蛋白扩散范围、扩散系数、运动速率变小,停留时间增长,且该效应具有浓度依赖性的特点。（3）通过MATLAB软件追踪LatB、Oryzalin、MβCD和纤维素酶处理后的AtGLR3.4蛋白,探究了细胞壁、膜筏和细胞骨架对AtGLR3.4蛋白运动的影响,发现对AtGLR3.4蛋白动力学特征影响最大的是细胞壁,其次是膜筏,影响最小的是细胞骨架。综上所述,本研究应用VA-TIRFM技术、激光共聚焦显微技术以及其它细胞生物学和生化方法,在单分子水平上,对AtGLR3.4蛋白动力学特征进行了分析。研究发现:（1）AtGLR3.4在细胞质膜上的寡聚状态和定位是高度动态的;（2）不同配体Glu、GABA和GSH处理后,AtGLR3.4蛋白的运动特征发生明显变化,其中GSH处理后AtGLR3.4蛋白运动特征变化最显著,且该效应是浓度依赖性的;（3）通过探究影响AtGLR3.4蛋白运动的因素发现,对GLR3.4蛋白运动影响最大的是细胞壁,其次是膜筏,影响最小的是细胞骨架。这些结果揭示了不同配体处理后AtGLR3.4蛋白的动态变化规律及影响AtGLR3.4蛋白动力学特征的关键因素,为进一步阐明细胞膜蛋白的动态调控及信号传导机制提供了依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩写符号及中英文对照表
• 1 引言
•   1.1 谷氨酸受体研究进展
•     1.1.1 动物中谷氨酸受体的结构及其功能
•     1.1.2 植物中谷氨酸受体的结构及其功能
•     1.1.3 拟南芥中谷氨酸受体AtGLR3.4的研究进展
•   1.2 细胞骨架、膜微区和细胞壁对膜蛋白运动的影响
•     1.2.1 细胞骨架对膜蛋白运动的影响
•     1.2.2 膜微区对膜蛋白运动的影响
•     1.2.3 细胞壁对膜蛋白运动的影响
•   1.3 植物膜蛋白在膜上动态变化
•     1.3.1 活细胞的单分子研究技术
•       1.3.1.1 可变角全内反射荧光显微技术
•       1.3.1.2 超高分辨显微技术
•       1.3.1.3 荧光相关光谱技术
•     1.3.2 植物膜蛋白在质膜上运动检测
•       1.3.2.1 单颗粒示踪技术
•       1.3.2.2 膜蛋白的动力学特征
•   1.4 本论文研究的意义和研究内容
• 2 实验材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 拟南芥材料
•     2.1.2 烟草材料
•     2.1.3 菌株
•     2.1.4 质粒
•     2.1.5 试剂
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 拟南芥总RNA的提取
•     2.2.2 cDNA的合成
•     2.2.3 拟南芥基因组DNA的提取
•     2.2.4 突变体的鉴定
•     2.2.5 拟南芥总蛋白提取
•     2.2.6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
•     2.2.7 蛋白免疫印迹（Western Blot）
•     2.2.8 荧光定量PCR
•     2.2.9 VA-TIRFM图像采集及处理
•     2.2.10 单分子追踪与分析
•     2.2.11 激光扫描共聚焦显微镜观察
•     2.2.12 Fluo-3/AM标记以及Confocal观察
• 3 实验结果与分析
•   3.1 AtGLR3.4-GFP的在各组织中定位
•     3.1.1 AtGLR3.4-GFP在各组织中的定位
•     3.1.2 AtGLR3.4-GFP主要定位于质膜
•   3.2 氨基酸处理对AtGLR3.4植株生长的影响
•   3.3 AtGLR3.4-GFP在质膜上的动力学行为
•     3.3.1 AtGLR3.4-GFP在质膜上的单分子成像
•     3.3.2 AtGLR3.4在质膜上的分布状态
•     3.3.3 AtGLR3.4-GFP的运动模式
•   3.4 氨基酸处理对AtGLR3.4-GFP在质膜上的动力学特征的影响
•     3.4.1 不同配体氨基酸处理对AtGLR3.4-GFP动力学特征的影响
•     3.4.2 不同浓度氨基酸处理对AtGLR3.4-GFP动力学特征影响
•   3.5 细胞骨架、膜筏和细胞壁对AtGLR3.4-GFP蛋白运动的影响
• 4 讨论
•   4.1 AtGLR3.4-GFP的组织分布和动力学行为
•   4.2 氨基酸处理影响AtGLR3.4-GFP动力学行为
•   4.3 细胞壁、膜筏和细胞骨架影响AtGLR3.4-GFP的运动
• 5 结论和展望
• 参考文献
• 个人简介
• 导师简介
• 获得成果目录简介
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 何丽娜

导师: 林金星

关键词: 蛋白运动,动力学特征,单分子研究

来源: 北京林业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 北京林业大学

分类号: Q945

DOI: 10.26949/d.cnki.gblyu.2019.001239

总页数: 68

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