绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种双重TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立及应用

论文摘要

绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae, Mo）和丝状支原体山羊亚种（M. mycoides subsp.capri, Mmc）是引起羊支原体性肺炎（M. pneumonia of sheep and goats, MPSG）的主要病原。为了快速鉴别引起MPSG的主要病原,建立一种可以同时检测Mo和Mmc的双重TaqMan探针荧光定量PCR （Realtime fluorescence quantitative PCR, q RT-PCR）检测方法。根据Mo p113序列和Mmc MLC1770（hypothetical protein gene）序列,利用Beacon Designer 7.9结合NCBI Blast软件分析,分别设计出针对Mo和Mmc的特异性引物和探针。通过对引物浓度、探针浓度和退火温度等反应条件的优化,建立了双重TaqMan探针qRT-PCR方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行了验证。结果表明,建立的双重TaqMan探针qRT-PCR的标准曲线相关系数R2分别为0.998和0.999,扩增效率分别为94.8%和97.0%;该方法对其他羊常见病原均无扩增信号,证明该方法具有良好的特异性;该方法对Mo和Mmc的最低检测限均为100 copies/μL,敏感性是常规PCR的100倍;组内和组间变异系数都低于2%,说明重复性好。应用该方法对福建省内收集的187例临床样品进行检测,结果显示,Mo的阳性率为47.6%（89/187）,Mmc的阳性率为11.8%（22/187）,两种病原体混合感染阳性率为10.2%（19/187）。以上数据结果表明,本研究建立的方法可用于临床上Mo和Mmc的准确、快速检测。本研究为Mo和Mmc的快速检测及流行病学提供了技术支撑。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 菌株和临床样品
•   1.2 主要仪器与试剂
•   1.3 引物及探针的设计和合成
•   1.4 DNA模板的提取
•   1.5 标准品的构建
•   1.6 双重TaqMan探针qRT-PCR方法反应条件的优化
•   1.7 双重TaqMan探针qRT-PCR方法的特异性实验
•   1.8 双重TaqMan探针qRT-PCR方法标准曲线的建立
•   1.9 双重TaqMan探针qRT-PCR方法敏感性实验
•   1.1 0 双重TaqMan探针qRT-PCR方法重复性实验
•   1.1 1 临床应用
• 2 结果与分析
•   2.1 双重TaqMan探针qRT-PCR方法的建立及优化
•   2.2 双重TaqMan探针qRT-PCR特异性实验
•   2.3 双重TaqMan探针qRT-PCR的标准曲线的建立
•   2.4 双重TaqMan探针qRT-PCR敏感性实验
•   2.5 双重TaqMan探针qRT-PCR的重复性实验
•   2.6 临床样品检测
• 3 讨论
• 4 结论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 林裕胜,李莎莎,江锦秀,张靖鹏,游伟,胡奇林

关键词: 绵羊肺炎支原体,丝状支原体山羊亚种,探针荧光定量

来源: 农业生物技术学报 2019年05期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

基金: 国家重点研发计划项目(No.2016YFD0500906),福建省公益科研院所专项(No.2018R1101014-17),福建省农业科学院科技创新项目(No.PC2018-6),福建省农业科学院科技创新团队PI项目(No.2016PI-7),福建省农业科学院青年创新团队(No.STIT2017-3-10)

分类号: S852.62

页码: 943-950

总页数: 8

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