鱼源致腐菌荧光假单胞菌群体感应LuxI/LuxR鉴定及生理功能研究

论文摘要

荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）具有较高的蛋白质、脂质水解力,和良好的嗜冷性,是生鱼、肉类和乳制品中重要的革兰氏阴性腐败菌。群体感应是一种细胞间的交流机制,参与毒力因子分泌、生物被膜形成、食品腐败等的调控。现有研究表明希瓦氏菌、气单胞菌、假单胞菌等革兰氏阴性的致腐性与群体感应密切相关,然而,,P.fluuoescens中AHLs介导的QS系统分子信息及其调控生物被膜、腐败和抗胁迫性的机制的研究较少。鉴于此,本研究以冷藏腐败大黄鱼中分离鉴定的优势腐败菌P.fluorescensPF07为研究对象,采用生物报菌法和高效液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）检测PF07中的AHLs活性,利用基因框架测序技术预测PF07全基因组,并对获得的LuxI和LuxR蛋白进行生物信息学分析;构建并验证luxl和luxR基因缺失株,比较研究野生株和缺失株的生长、生物被膜、致腐表型及抗胁迫性差异变化,评价luxI基因缺失株中外源添加C4-HSL的影响;基于转录组学测序技术研究luxI和luxR基因缺失对P.fluorescens的基因表达及代谢通路的影响,旨在更加全面地了解致腐菌LuxI和LuxR系统,为研发新型食品保鲜剂提供理论支持。主要结果如下:研究发现PfuorescensPF07上清液中含有C4-HSL、C10-HSL和C14-HSL三种信号分子,且C4-HSL含量最高。PF07基因框架测序显示,预测全基因组大小约为6.59Mb,编码基因约5573个,长度约为5,352,570bp。PF07中预测出的ncRNA 有 3 种（tRNA,rRNA 和 sRNA）,Prophage 有 6 个,CRISPRs 有 70 个,次级代谢产物基因簇6种,其中hserlactone（homoserine lactone）是与群体感应相关的基因簇。采用COG聚类分析PF07功能时,从Signal transduction mechanism类型的基因中发现群体感应相关的合成酶GM004424（LuxI）和受体蛋白GM004425（LuxR）。两个蛋白的生物信息学分析发现,PF07中LuxI/LuxR与荧光假单胞菌PFuk4中同源蛋白具有高度的同一性和相似性,并且与其他菌株中六种LuxI型合成酶和LuxR受体蛋白具有相同的保守氨基酸和相似的蛋白质3D结构,因此认为PF07中LuxI/LuxR是一对同源的群体感应合成酶和受体蛋白。构建了P.fuorescensPF07luxl和luxR基因缺失株,比较分析野生株及两株突变株△luxI/△luuxR在生物被膜形成、致腐能力和抗胁迫性间的差异,并评价C4-HSL添加对△luxI的影响。结果发现,缺失株△luxI中C4-HSL几乎散失,△luxR中降低约38.60%,但对C10-HSL和C14-HSL活性无影响。在30℃和4℃下luxI和luxR基因缺失对细菌生长无影响,分别在18 h和144 h达到稳定期。luxI和luxR基因缺失都导致生物被膜的形成减弱,且降低细菌的粘附能力及胞外多糖形成量,却促进细菌泳动性。△luxI和△luxR在30℃下被膜结晶紫量分别降低17.22%和14.56%,而4℃分别减少27.51%和22.48%;C4-HSL部分回补被膜含量,30℃和4℃下最高分别回复12.82%和23.66%。CLSM显示两种温度下△luxI和△luxR形成的被膜都更薄且结构较疏松,SEM观察到AluxI和AluxR胞外分泌物减少。luxI和luxR基因缺失也降低菌体胞外蛋白酶和嗜铁素的产生,特别是蛋白酶活性,最高时分别降低了 11.94%和12.51%,但不影响TVB-N含量。外源添加C4-HSL可部分恢复△luxl中嗜铁素和蛋白酶的缺陷,其中对蛋白酶作用较弱,最高仅能恢复 9.2%。此外Aluxl和AluxR在20mM H2O2、30%（m/v）NaCl、50℃和 150μg/mL结晶紫中的抗胁迫力弱于野生株,其中H2O2处理三者间差异最大,野生株的存活率分别是△luxR和AluxI的15.31倍和18.71倍。转录组学分析显示,P.fuorescensPF07中LuxI/LuxR敲除会影响多种生物被膜相关的基因,包括下调多糖相关的基因、上调pst系统相关的基因,AluxR中还上调PhoB/U双组分系统。而对pst系统与PhoB/U双组分系统基因上调,可能导致下调细胞内c-di-GMP含量,从而促进细胞的泳动性。同时,两个缺失株△luxI和△luxR中参与胞外蛋白酶产生（aprX）,嗜铁素生物合成（ornithine monooxygenase）和应激反应（rpos、OmsC、HslV）基因的下调。还有在△luxR和△luxI中其他与腐败相关基因的表达水平也下调,如脂质代谢,硫化合物代谢,芳香族化合物和氨基酸代谢,异味产生等;LuxR在△luxI中的表达水平下调。外源添加C4-HSL仅恢复AluxI的部分基因,如与嗜铁素合成相关的基因ornithine monooxygenase、与多糖合成相关的基因 polysaccharide biosynthesis protein,与绿脓素产生相关基因pyocinR2holin,与应激反应相关基因osmC,hslV等。采用荧光定量PCR,研究验证aprX、fihA、luxI、luxR、orm、pbp和rpoS基因在四组菌中表达量的变化,其结果与转录组测序基本一致,且都能映证表型变化的结果,证明转录组测序结果较为可靠。研究表明,LuxI/LuxR是荧光假单胞菌PF07中一对同源的群体感应合成酶和受体蛋白,且LuxI/LuxR能通过上调多糖相关的基因、下调pst系统相关基因及PhoB/U双组分系统基因来促进生物被膜的形成,上调胞外蛋白、嗜铁素、脂质代谢等腐败相关基因来促进腐败,以及上调应激反应相关基因来提高其抗胁迫性。从生理表型和基因表达差异变化,证实了群体感应LuxI/LuxR对荧光假单胞菌被膜形成、致腐能力以及抗胁迫性的正向调节作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
•   1.1 生鲜食品中的腐败菌
•     1.1.1 食品腐败菌类型
•     1.1.2 荧光假单胞菌
•   1.2 革兰氏阴性菌与群体感应
•     1.2.1 群体感应
•     1.2.2 自诱导物、合成酶、受体及特异性
•       1.2.2.1 自诱导物
•       1.2.2.2 AHLs合成酶
•       1.2.2.3 受体及特异性
•     1.2.3 群体感应与食品腐败
•     1.2.4 群体感应与细菌生物被膜形成
•     1.2.5 群体感应与细菌抗胁迫性
•   1.3 假单胞菌中的群体感应
•     1.3.1 铜绿假单胞菌中的群体感应
•     1.3.2 荧光假单胞菌中的群体感应
•     1.3.3 其他假单胞菌中的群体感应
•   1.4 本课题的研究目的、意义和内容
• 第二章 荧光假单胞菌PF07基因组中LuxI/LuxR生物信息学分析
•   2.1 前言
•   2.2 材料与设备
•     2.2.1 菌株及培养条件
•     2.2.2 试剂
•     2.2.3 主要仪器设备
•   2.3 试验方法
•     2.3.1 报告菌法和LC/MS-MS检测P.fluorescens PF07信号分子活性
•       2.3.1.1 PF07生长曲线测定
•       2.3.1.2 报告菌法检测PF07信号分子活性
•       2.3.1.3 PF07信号分子提取
•       2.3.1.4 LC/MS-MS检测PF07信号分子
•     2.3.2 菌体的培养与收集
•     2.3.3 总DNA的提取及全基因组测序
•     2.3.4 文库构建与质检
•     2.3.5 P.fluorescens PF07基因组组分分析
•     2.3.6 P.fluorescens PF07基因功能注释
•     2.3.7 P.fluorescens PF07 Lux/LuxR基因PCR扩增
•       2.3.7.1 DNA提取
•       2.3.7.2 引物设计及PCR扩增
•     2.3.8 LuxI/LuxR同源性、保守位点分析及三维结构模拟
•   2.4 数据处理和分析
•   2.5 结果分析
•     2.5.1 报告菌法分析PF07信号分子活性
•     2.5.2 LC/MS-MS检测P.fluorescens PF07信号分子活性
•     2.5.3 DNA文库构建与测序质量评估
•       2.5.3.1 测序数据概况
•       2.5.3.2 基因组大小预测
•       2.5.3.3 基因组组装分析
•     2.5.4 P.fluorescens PF07基因组组分分析
•       2.5.4.1 编码基因预测
•       2.5.4.2 ncRNA预测
•       2.5.4.3 Prophage预测
•       2.5.4.4 CRISPRs预测
•     2.5.5 P.fluorescens PF07基因功能分析
•       2.5.5.1 P.fluorescens PF07蛋白质COG聚类分析
•       2.5.5.2 P.fluorescens PF07次级代谢基因簇分析
•     2.5.6 PCR验证P.fluorescens PF07中LuxI与LuxR基因
•     2.5.7 LuxI/LuxR进化树、保守位点分析及三维结构模拟
•   2.6 讨论
• 第三章 LuxI/LuxR缺失对PF07生物被膜、致腐及抗胁迫力的影响
•   3.1 前言
•   3.2 材料与设备
•     3.2.1 材料、菌株及培养条件
•     3.2.2 试剂
•     3.2.3 主要仪器设备
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 LuxI及LuxR缺失株的构建
•     3.3.2 LuxI及LuxR缺失株基因缺失验证
•       3.3.2.1 DNA提取
•       3.3.2.2 引物设计及PCR扩增
•     3.3.3 报告菌法及LC-MS/MS检测AHLs活性
•     3.3.4 野生株和缺失株的生长能力比较
•     3.3.5 野生株和缺失株的生物被膜形成能力测定
•       3.3.5.1 结晶紫法测定生物被膜量
•       3.3.5.2 粘附能力测定
•       3.3.5.3 水溶性胞外多糖含量检测
•       3.3.5.4 CLSM及SEM观察粘附被膜
•       3.3.5.5 泳动能力测定
•     3.3.6 野生株和缺失株在鱼汁中腐败能力测定
•       3.3.6.1 灭菌鱼汁制备和接种
•       3.3.6.2 鱼汁中生长曲线测定
•       3.3.6.3 胞外蛋白酶活性测定
•       3.3.6.4 嗜铁素相对含量测定
•       3.3.6.5 TVB-N含量测定
•     3.3.7 野生株和缺失株抗胁迫力的测定
•   3.4 数据处理和分析
•   3.5 结果分析
•     3.5.1 △luxR和△luxI基因缺失验证
•     3.5.2 生物报告菌法和LC-MS/MS检测野生株和缺失株AHLs活性
•     3.5.3 野生株和缺失株的生长
•     3.5.4 野生株和缺失株生物被膜形成比较
•       3.5.4.1 生物被膜结晶紫定量比较
•       3.5.4.2 粘附能力
•       3.5.4.3 水溶性胞外多糖含量比较
•       3.5.4.4 CLSM及SEM观察被膜结构差异
•       3.5.4.5 泳动能力比较
•     3.5.5 野生株和缺失株抗胁迫力比较
•     3.5.6 野生株和缺失株在鱼汁中腐败能力比较
•       3.5.6.1 鱼汁中生长差异的比较
•       3.5.6.2 胞外蛋白酶活性分析
•       3.5.6.3 嗜铁素相对含量比较
•       3.5.6.4 TVB-N含量比较
•   3.6 讨论
• 第四章 基于转录组学分析LuxI/LuxR对PF07生理功能调控的机制
•   4.1 前言
•   4.2 材料与仪器
•     4.2.1 主要试剂和培养基
•     4.2.2 主要仪器
•   4.3 转录组学测序
•     4.3.1 细菌培养及样品制备
•     4.3.2 样品总RNA提取纯化及质量检测
•     4.3.3 文库构建与测序
•     4.3.4 质量控制与参考基因组比对分析
•     4.3.5 基因表达水平分析及差异基因筛选
•     4.3.6 差异基因筛选
•     4.3.7 差异表达基因的GO富集
•     4.3.8 差异表达基因的KEGG pathway富集
•   4.4 荧光定量PCR验证
•     4.4.1 样品总RNA提取
•     4.4.2 总RNA反转录
•     4.4.3 荧光定量PCR
•   4.5 数据处理和分析
•   4.6 结果与分析
•     4.6.1 转录组reads质量与统计分析
•     4.6.2 差异基因表达分析
•     4.6.3 差异基因聚类分析
•     4.6.4 差异表达基因GO富集分析
•     4.6.5 差异表达基因GO富集分析KEGG Pathway富集分析结果
•     4.6.6 差异表达基因分类整理
•       4.6.6.1 LuxI/LuxR敲除对P.fluorscens生物被膜相关基因的影响
•       4.6.6.2 LuxI/LuxR敲除对P.fluorscens致腐性相关基因的影响
•       4.6.6.3 LuxI/LuxR敲除对P.fluorscens抗胁迫能力相关基因的影响
•     4.6.9 荧光定量PCR验证
•       4.6.9.1 PCR产物扩增曲线及引物特异性分析
•       4.6.9.2 基因表达量差异
•     4.6.10 群体感应LuxI/LuxR调控机制模拟图
•   4.7 讨论
• 第五章 总结、创新点和展望
•   5.1 总结
•   5.2 创新点
•   5.3 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录Ⅰ 转录组学差异基因列表
• 附录Ⅱ 攻读硕士学位期间主要研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 唐蓉

导师: 朱军莉

关键词: 荧光假单胞菌,群体感应,生物被膜,腐败,抗胁迫性

来源: 浙江工商大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 浙江工商大学

分类号: TS201.3

总页数: 112

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