一、HLA-肽复合物研究HBV/C区变异对HLA-A2限制性表位的影响（论文文献综述）
蔡林[1]（2019）在《藏族人群HBV准种变异特征及其HLA限制性研究》文中研究指明研究背景:HBV在乙肝患者体内以准种的形式存在,早已经被学者证实。HBV病毒变异的多样性,既与病毒自身复制时多聚酶缺乏校正功能,容易产生随机突变有关,还与宿主免疫状态、抗病毒治疗的干预有关。不同的人群、不同的疾病阶段都会有不同的HBV准种变异特点。HBV准种变异与乙肝的诊断、治疗、疾病转归息息相关。目前研究较多的变异是HBV BCP区、preC/C区、preS/S区、RT区,例如BCP区的A1762T/G1764A双突变、preC区G1896A突变都会导致C基因转录的异常,会造成HBeAg合成障碍,且都与肝硬化、肝癌的发生有关。西藏地区地处高原地带,地理上、人文上都与外界相对隔离,在西藏藏族人群中,乙肝感染率高达12%以上,远高于国内平均感染率（6.1%）。目前对于藏族人乙肝病毒的研究发现,藏族人HBV流行株以C/D重组型为主,而汉族人以B、C型为主,目前对藏族C/D型HBV准种的研究较少,尚不清楚其是否具有独特的准种特点。HBV在人体内会受到宿主免疫压力的选择,病毒抗原经HLAⅠ类和Ⅱ类分子呈递表位肽,刺激CD8和CD4+T细胞应答,表位肽的变异会造成T细胞不能识别而出现免疫逃逸。因此不同HLA分子能驱动不同的HBV变异,对HBV变异存在限制性。目前研究较多的是HLAⅠ类分子限制的表位肽,例如HBV核心蛋白HBcAg 17-28aa是HLA-A2限制的抗原肽;对于藏族HBV感染者的HLA限制性目前则尚无相关研究。研究目的:本研究以西藏藏族乙肝感染者为研究对象,试图探讨藏族人HBV病毒准种特点,以及藏汉不同民族HLA遗传背景下对HBV的限制性,旨在加深HBV病毒准种变异及其HLA分子限制性的认识。方法:以1例C基因型HBV样本（pAAV-HBV质粒）为参考序列进行三代测序用于HBV全长准种分析的方法学探索,先对pAAV-HBV质粒进行HBV全长PCR扩增,在三个独立的测序单元（cell）中加入相同量的质粒扩增产物,通过BioEdit7.0、MEGA 7.0等生物信息工具对测序序列的分析,得出三代测序的错误率,以及用于准种分析的遗传距离、突变率的合理阈值。以2016-2017年在西藏藏南地区进行流行病学调查时采集到24例HBsAg阳性患者为研究对象,同时于2017年在西南医院感染科门诊匹配收集24例汉族乙肝感染者血液样本作为对照组。从100ul血清中提取HBV DNA,通过PCR扩增HBV全基因组,进而利用第三代DNA测序平台PacBio RS II对HBV进行全长测序;同时从血细胞样本中提取人gDNA,利用SBT（Sequence-Based Typing）分型方法对HLA-A、B、C、DRB1、DPA1、DPB1、DQA1、DQB1八个位点进行四位数字的高分辨率分型。利用PacBio SMRT Tools进行测序数据的拆分及CCS（Circular consensus sequences）序列的生成;序列编辑用BioEdit7.0完成;序列比对用Clustal W 2.1、Muscle 3.8、T-Coffee11.0来完成。核酸替换模型的测试用Modeltest3.7完成。系统进化分析采用MEGA 7.0进行,进化树的构建采用邻接法（Neighbor-Joining）,进化树可靠性分析采用自助抽样法（Bootstrip Method）,Bootstrip重复次数选择500次以上。进化树的分析处理采用FigTree v1.4.3完成。重组分析采用Stuart C.Ray开发的SimPlot 3.5进行。病毒准种特点用两种方法描述:香农熵（Shannon entropy,Sn）和平均遗传距离（mean genetic distance,d）,前者计算公式为:Sn=-Σi（piInpi）/InN,pi为第i个种群序列出现的频率,N为总的种群数量。遗传距离用MEGA 7.0计算,核酸替换模型选择TN+G（Tamura-Nei model+Gamma distribution）,同时用校正的Nei-Gojobori method（Jukes-Cantor）+G模型计算同义突变率（Synonymous mutation,dS）及非同义突变率（Nonsynonymous mutation,dN）。借助人工神经网络在线工具NetMHC 4.0 Server和NetMHCⅡ2.3 Server分别预测HLAⅠ、Ⅱ类分子与HBV肽段的亲合力（网址:https://www.cbs.dtu.dk/services/）。结果:1.第三代测序平台PacBio RS II用于HBV全长测序方法具有可行性,平均读长可达到3.4kb,其测序总错误率为2.13%,插入错误为主,其次为缺失和错配,分别为1.45%、0.62%、0.06%。测序读长越长,测序错误率就越低。运用生物信息学方法删除插入错误后总错误率降低到0.69%下。HBV准种分析中将遗传距离阈值设定为0.01,突变筛查阈值设定为3.5%。2.藏族人HBV以C/D重组型为主,且有两种重组类型:C2/D4型与C2/D3型,前者是D4型的1-750nt片段与C2型重组,后者是D3型的1-1500nt片段与C2型发生重组。C2/D4为主要的优势毒株（77.8%）。3.C/D重组型HBV比对照组在preC/C区有更高的复杂度（P=0.006）和非同义突变率（P=0.006）。C/D型HBV准种变异主要集中在EnhⅡ区（1636-1744nt）、BCP区（1742-1849nt）和preS区（2848-152nt）,包括C1653T突变（44.4%）、T1753V/A1762T/G1764A三联突变（44.4%）、preS的缺失突变（33.3%）等。汉族对照样本变异集中在preC、S基因、X基因,包括G1896A变异（35.0%）、sS143T变异（70.0%）,及xV5L变异（75.0%）等。4.藏族人HLAⅡ类分子基因型HLA-DRB1*12:01:01G（55.6%vs 5.6%,P=0.008）、DQA1*05-DQB1*03:01（77.8%vs 16.7%,P=0.004）要多于汉族人,而HLAⅠ类分子中HLA-B*40:01比汉族对照少（0%vs 50.0%,P=0.012）。提示藏族人HLA的遗传背景不同与汉族人。5.HBV X基因36aa（1479nt）位点变异在HLA-DRB1*12:01:01G样本中更多见（66.7%vs 14.3%,P=0.024）,P基因268aa（3108nt）位点变异在HLA-DQA1*05-DQB1*0301样本中更多见（50.0%vs 5.9%,P=0.015）,前者可能位于DRB1*12:01:01G限制的表位区,后者可能位于DQA1*0501-DQB1*0301限制的表位区。提示在藏族人与汉族人在自身不同的HLA遗传背景下,会驱动不同的HBV准种变异。总结:我们探索了第三代测序技术用于HBV全长准种分析的具体方法,确立了HBV准种遗传距离及突变的阈值。发现了C2/D4重组型HBV是藏族人中的优势毒株,同时在HBV全基因组水平探讨了藏族、汉族不同的乙肝病毒准种变异特点。结合HLAⅠ类、Ⅱ类分子的高分辨率分型,初步认识了藏族、汉族人HLA分子的差异,及其对HBV准种变异的限制性。
李彤亚[2]（2019）在《HIV和HBV病毒蛋白同宿主细胞的相互作用机制研究》文中研究指明由人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）感染引起的获得性免疫缺陷综合症（acquired immunodeficiency syndrome,ADIS）是威胁人类最严重的传染病之一,它能破坏人体的免疫系统降低机体的免疫力,并引发严重的并发症,目前没有特效的治疗药物,HIV致病机制研究及药物靶标寻找的是对于人类健康和社会稳定有重要意义。Nef蛋白是HIV的负调控因子,主要表达于CD4+T细胞。Nef诱导的AIDS样症状主要表现为凋亡细胞的增加,且Nef基因突变或者缺失与长期不发病或病程进展缓慢的AIDS（Long-term Nonprogressors/Slowprogressors,LTNP/LTSP）的发生显着相关。Nef能下调CD4、CD28、CD86、MHC-I、MHC-II等细胞表面受体的表达,干扰免疫细胞的监视和清除,实现HIV-1的免疫逃逸;还能通过与诱凋亡因子及某些激酶直接结合抑制凋亡通路,使被感染细胞的存活期延长,利于病毒复制和感染力增强。我们通过酵母双杂交实验发现了Nef与细胞色素b（cytochrome b,Cyto b）C端（169-380 aa）存在相互作用,并通过免疫共沉淀验证了两者能在体内结合。而且我们发现Cyto b与Fas介导的凋亡有关。目前对于线粒体参与的凋亡通路,研究者的目光大都聚集在Cyto c上,Cyto c是线粒体凋亡通路的核心蛋白,通过与Apaf-1等辅助蛋白形成凋亡体,活化caspase并激发级联反应最终导致细胞的凋亡。而我们的研究结果证明Cyto b介导的凋亡与Apaf-1形成凋亡体无关,独立存在于Cyto c经典凋亡通路之外。我们的研究还发现,Nef可以抑制Apaf-1诱导的细胞凋亡,这说明了Nef是Cyto c凋亡通路的负调控因子。此外,我们用Fas的单抗C11刺激细胞的Fas凋亡通路,证明了Nef能通过直接与Cyto b的结合抑制Fas凋亡信号诱导的细胞凋亡。我们利用B型HIV-1的假病毒HIV-1BA-L感染Jurkat T细胞,证明了HIV-1可以通过与Cyto b的结合抑制Fas凋亡通路。迄今为止,关于Cyto b相关的凋亡通路及其机制的研究较少,我们的研究在这方面做出了初步探索,对于加深Nef诱导免疫逃逸机制的认识具有重要意义,也提供了治疗HIV的潜在靶点,然而深入的机制仍需进一步发现。乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染可以引起急、慢性肝炎,还与肝衰竭、肝硬化以及肝癌的发生发展有密切关系。乙型肝炎（Hepatitis B）是全球范围内的重要传染病,有较高的传染性和致死率。目前对于乙肝仍然缺乏有效的治疗药物。乙肝的治疗目标是持续抑制HBV的复制,减少肝细胞损伤,延缓肝炎演变为肝硬化（liver cirrhosis,LC）和肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）的进程。HBV很难在体内完全清除,这与其复杂的免疫逃逸机制有关。干扰素（interferon,IFN）是一种广泛表达的细胞因子,具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生物学活性。IFN的生理作用是通过信号通路调节IFN诱导基因的转录来实现的。病毒感染首先诱发机体的天然免疫,IFN诱导的效应因子的表达是机体抗病毒感染的第一道防线。因而,研究HBV逃避IFN相关的天然免疫的机制的研究有重要的现实意义。干扰素诱导跨膜蛋白家族（interferon-inducible transmembrane protein,IFITM）是IFN的诱导重要的抗病毒、抗肿瘤的效应因子。它们主要由IFNγ通过诱导Jak-stat1信号通路诱导产生,具有广谱的抗病毒效应,如艾滋病毒（HIV）、SARS冠状病毒（SARS-CoV）、甲型流感病毒（IAV）、登革热病毒（DFV）和水泡性口膜炎病毒（VSV）等。但是,IFITM抗HBV的机制鲜见报道。HBV e蛋白有较强的免疫调节作用,与乙肝的发病机制有着密切的关系。我们为了研究HBV免疫逃逸的可能机制,首先利用酵母双杂交实验筛选能与HBe相互作用蛋白,发现ARID2编码的BAF200蛋白与HBe存在直接的相互作用。然而,HBe作为一种分泌蛋白,实际上难以在空间上与定位于核内的BAF200发生相互作用。但是,与HBe的基因序列大部分相同的HBV核心蛋白（HBc）大多位于胞质,于是我们推测HBc也可能与BAF200存在体内的相互作用。为验证此想法,我们进行了免疫共沉淀实验,实验结果表明HBc和BAF200确实存在体内的相互作用。SWI/SNF家族是染色质重构复合物。SWI/SNF家族有BAF复合物和PBAF复合物两种形式,组成它们的亚基大多数是相同的,但BAF250只存在于BAF复合物,而BAF200和BAF180是PBAF的特有的亚基。据报道,只有PBAF复合物能调节细胞内核受体-配体依赖的转录活动。我们通过实验证实了,IFITM1的表达依赖于BAF200而并非BAF180。而且,我们发现IFNα对BAF200的调控并不STAT1的磷酸化,暗示IFNα诱导IFITM1的信号通路并不是JAK-STAT1途径。我们将pHBV1.31质粒转染HepG2细胞,并通过ELISA实验和荧光定量PCR,证明了IFNα的刺激可以显着降低HBeAg、HBsAg含量以及HBV DNA的拷贝数。这说明IFNα对HBV有抗病毒作用。此外,我们在HepG2和HepG2.2.15细胞内,通过干扰IFITM1基因的转录,证实了IFITM1介导了IFNα诱导的抗细胞生长作用。我们的实验还证明了,HBc能通过与BAF200的结合抑制IFNα诱导的IFITM1的表达,这可能是HBV免疫逃逸的机制之一,因而本研究为抗HBV复制和抗乙肝药物的研发提供了新思路。综上,我们探讨了关于HIV Nef蛋白和HBV HBc蛋白对宿主细胞的相互作用有机制,丰富和补充了对两种病毒感染及免疫逃逸机制的认识。
邹淑慧,肖九长,张丽琴,唐金凤,刘奕红[3]（2016）在《乙型肝炎病毒特异性CTL表位变异分析》文中研究指明目的初步调查乙型肝炎病毒（HBV）特异性CTL表位的序列特点,同时探讨乙型肝炎重症化和慢性化的可能机理。方法本研究采用PCR扩增法获取HBV全基因并测序,参考国外文献报道的17个热点HBV特异性CTL表位氨基酸序列,分析其与本文获得的CTL表位氨基酸序列的差别。对患者各个表位变异的差异进行卡方检验。结果获得46份HBV全基因组序列,急性乙型肝炎（AHB）15例,慢性乙型肝炎（CHB）18例,慢性重型乙型肝炎（CSHB）13例。其中40份属于B基因型,6份属于C基因型。对17个表位进行分析发现,B基因型中变异较大的表位有S183-191,S382-390,C18-27,X36-44,X52-60和X115-123;C基因型中有P816-824,C18-27,X36-44,X52-60和X115-123。P816-824表位在CHB和CSHB组的变异率为27.8%和46.2%,显着高于AHB组（0%,P<0.01）;C23-31表位在CHB组的变异率为22.2%,显着高于AHB和CSHB组（0%,0%,P<0.05）。结论了解HBV CTL表位序列特点,分析其与文献报道的CTL表位的差异情况,对防治乙型肝炎的重症化和慢性化具有指导意义。
樊淑华[4]（2016）在《猪MHCI晶体结构及结合IAV和PRRSV表位特性的研究》文中进行了进一步梳理主要组织相容性复合体Ⅰ（Major Histocompatibility Complex,MHC I）编码的分子是参与抗原提呈,激活细胞毒性T细胞（Cytotoxic Lymphocyte,CTL）产生特异性免疫应答的关键分子。CTL细胞通过特异性识别抗原肽-MHC复合物（peptide-MHC complex,pMHC）而启动。不同MHC分子可选择性地结合具有不同锚定位和锚定残基的肽段,造成不同个体对同一抗原的应答在强度上出现差异。从不同种属和个体MHC分子群中筛选、鉴定出特定病原的优势pMHC分子,并进一步阐述其结构和功能机理及应用潜力是一项十分新颖的重要研究课题。本研究选择中国地方特色猪种藏香猪和黑山猪,采用PCR技术从藏香猪组织中克隆了 21条猪MHC Ⅰ（swine leukocyte antigen,SLAⅠ）基因,与实验室已克隆的28条黑山猪基因、44条长白猪基因以及IPD-MHC数据库中所有经典的SLA Ⅰ有效全长基因（86条）的胞外区一起构建了系统发育树,采用Wu-kabat法分析了三个猪种的高变异位点,并将组成多肽结合槽（peptide binding groove,PBG）的高变异位点定位到SLA Ⅰ三维结构（3D）上,证实了构成多肽结合槽的高变异位点能够影响SLA Ⅰ呈递多肽表位的特性。应用生物信息学方法预测了藏香猪、黑山猪和长白猪结合PRRSV和IAV多肽的能力,并通过体外复性实验筛选了能够结合更多表位多肽的优势SLA Ⅰ分子。采用蛋白结晶技术解析了黑山猪SLA-3*hs0202与流感病毒血凝素蛋白（HA-KMN9）复合物晶体结构。该结构在一个不对称晶胞内包含两个pSLA Ⅰ分子,且两分子中HA-KMN9多肽具有不同的构象。另外,与已解析的其他MHC晶体结构不同,同一晶胞中的两个分子RMSD值为0.873 A,远远高于同一晶胞中存在两个分子的猪SLA-1*0401（0.401 A）和牛BoLA-N*01801（0.267 A）。进一步分析发现,多肽构象的差异不仅与多肽结合槽（PBG）氨基酸的侧链有关,还与α1、α2主链的偏移有关。该结果表明,MHC分了碳主链的柔韧性也可能导致多肽构象的差异,从而更有利于多肽与TCR的结合。另外,本研究通过体外复性实验筛选了藏香猪SLA-1*0501分子结合的PRRSV表位肽,并通过蛋白结晶技术解析了藏香猪SLA-1*0501 与PRRSV-GP3ALL9多肽的晶体结构（pSLA-1*0501）。根据多肽P2位和Pc锚定残基预测了 SLA-1*0501结合PRRSV病毒株（VR-2332、JXwn06 毒株）表位多肽。构建了藏香猪 SLA-1*0501-BSP/ALL9、SLA-1*0501-BSP/RLY9 两条多肽的四聚体,并验证了 GP5-RLY9多肽的生物学活性。综上所述,本研究通过生物信息学方法和体外复性实验,筛选了藏香猪、黑山猪优势SLA Ⅰ分子。解析了黑山猪SLA-3*hs0202结合流感病毒表位复合物的晶体结构,阐明了SLA Ⅰ分子递呈流感抗原多肽的分子机制。解析了藏香猪SLA-1*0501结合PRRSV表位肽的晶体结构,并制备了藏香猪SLA-1*0501-BSP结合PRRSV多肽的四聚体。研究结果推进了猪分子免疫学的发展,为猪抗病育种及病毒表位疫苗的研发奠定了基础。
孙龙昊[5]（2014）在《AFP158-166特异性TCR转基因T细胞治疗肝癌的实验研究》文中研究表明第一部分：AFP158-166特异性TCR转基因T细胞的构建目的：构建AFP158-166特异性TCR转基因T细胞并鉴定其功能。方法：采集基因型HLA-A0201的健康志愿者单核细胞,制备负载AFP158-166表位肽的成熟树突状细胞（DC）,体外激活T细胞通过流式分选建立AFP158-166特异性T细胞克隆,获取并扩增AFP158-166特异性TCR基因,构建AFP158-166特异性TCR慢病毒载体,感染多克隆T细胞建立AFP158-166特异性TCR转基因T细胞。通过MHC五聚体检测转基因T细胞比例,以ELISPOT和细胞毒性实验进行功能鉴定。结果：（1）成功构建AFP158-166特异性TCR慢病毒载体VAT,可转染多克隆T细胞使其表达AFP158-166特异性TCR,构建AFP158-166特异性TCR转基因T细胞；（2）FCM检测Pro5AFP158-166-MHC五聚体和CD8双阳性细胞比例为1.8%；（3）ELSPOT检测显示AFP158-166特异性TCR转基因T细胞中分泌IFN-γ的细胞数是DC诱导的AFP158-166特异性T细胞中的1.8倍。（4）细胞毒性实验显示AFP158-166特异性TCR转基因T细胞较DC诱导的AFP158-166特异性T细胞对AFP+人肝癌细胞HepG2杀伤作用在效靶比10：1,20：1,30：1时分别从6.3±1.3%,17.9±5.2%,39.2±3.7%上升至11.3±2.9%,27.9±7.8%,62.7±10.4%,而对AFP-细胞无明显杀伤作用。结论：AFP158-166特异性TCR慢病毒载体VAT可转染多克隆T细胞构建AFP158-166特异性TCR转基因T细胞,对AFP+人肝癌细胞有特异性杀伤作用。第二部分：AFP158-166抗原肽与IL-15协同表达人工抗原递呈细胞的构建目的：构建AFP158-166抗原肽与IL-15协同表达人工抗原递呈细胞并鉴定其功能。方法：以AFP158-166抗原表位肽和IL-15协同表达质粒,构建慢病毒载体VA15转染人B细胞淋巴瘤细胞BJAB,以放射辐照抑制增殖,建立安全且稳定表达IL-15并递呈AFP158-166表位肽的人工抗原递呈细胞,通过ELISA、FCM和液相色谱-质谱联用分别鉴定IL-15、MHC分子、CD80、CD86、AFP158-166抗原肽的稳定表达,于体外诱导AFP158-166抗原特异性T细胞增殖,并以细胞毒性实验进行功能鉴定。结果：（1）成功构建AFP158-166抗原表位肽和IL-15协同表达慢病毒载体VA15,可转染BJAB细胞,获得协同表达AFP158-166抗原表位肽和IL-15的BJAB细胞单克隆BA15；（2）BA15可稳定表达AFP158-166抗原肽和IL-15；（3）20Gy剂量的137Csγ射线辐照可诱导凋亡有效阻滞BA15细胞增殖但不会使其迅速死亡；（4）20Gy剂量的137Csγ射线辐照不会影响BA15细胞表面MHC分子及协同刺激分子CD80、CD86的表达。（5）BA15可有效激活扩增AFP158-166抗原特异性T细胞,其功能较负载AFP158-166的DC无明显差异；（6）细胞毒性实验显示BA15诱导的AFP158-166特异性T细胞较DC诱导的AFP158-166特异性T细胞对AFP+人肝癌细胞HepG2杀伤作用在各效靶比无明显差异。结论：构建AFP158-166抗原肽与IL-15协同表达人工抗原递呈细胞可有效激活AFP158-166特异性T细胞,对AFP+人肝癌细胞有特异性杀伤作用。第三部分AFP158-166特异性转基因T细胞过继性免疫治疗的实验研究目的：以AFP158-166抗原肽与IL-15协同表达人工抗原递呈细胞BA15体外刺激AFP158-166特异性TCR转基因T细胞鉴定其功能变化。方法：体外非特异性激活HLA-0201健康志愿者淋巴细胞,以AFP158-166特异性TCR慢病毒VAT感染,制备AFP158-166特异性TCR转基因T细胞,并以本实验建立的AFP158-166抗原肽与IL-15协同表达人工抗原递呈细胞BAl5刺激扩增,通过MHC五聚体检测转基因T细胞比例变化,以细胞毒性实验进行体外实验功能鉴定。利用HepG2肝癌细胞NOD/SCID小鼠模型,进行AFP158-166特异性T细胞过继免疫治疗实验,观察治疗效果。结果：（1）经BA15刺激,AFP158-166特异性TCR转基因T细胞中Pro5AFP158-166-MHC五聚体和CD8双阳性细胞比例从1.8%上升至4.2%,CD8+T细胞/CD4+T细胞比例由0.42上升至1.10,但对AFP+人肝癌细胞HepG2的杀伤作用无明显变化。（2）AFP158-166特异性TCR转基因T细胞较负载AFP158-166表位肽DC诱导的AFP158-166特异性T细胞对于HepG2肝癌细胞NOD/SCID小鼠模型具有更好的治疗效果。结论：AFP158-166抗原肽与IL-15协同表达人工抗原递呈细胞BA15体外刺激AFP158-166特异性TCR转基因T细胞可提高转基因T细胞比例。AFP158-166特异性转基因T细胞过继性免疫治疗有效。
周霞[6]（2012）在《阿德福韦酯耐药模式及其免疫选择特性研究》文中提出背景与目的慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）感染是一个重大的公共健康问题，全世界约有4亿人慢性感染。乙型肝炎病毒（hepatiis B virus，HBV）高度流行区主要分布在南非、中国、东南亚、地中海地区。慢性乙型肝炎治疗，抗病毒是关键，将病毒复制控制在一个最低的水平，从而减缓或中止肝脏疾病的进程，预防并发症的出现。目前抗病毒治疗的药物主要有两种类型，IFN-γ和HBV逆转录酶抑制剂（NucleosideReverse Transcriptase Inhibitors，NRTIs）。IFN-γ的效果有限，约40%的患者对其低应答，NRTIs长期使用可产生耐药突变株及停药反弹。目前HBV逆转录酶抑制剂分为三种结构类型：L-核苷类似物，无环腺苷膦酸酯，脱氧鸟苷类似物。目前有5种NRTIs在美国和欧洲被批准用于HBV治疗：拉米夫定（LAM）、阿德福韦酯（ADV）、恩替卡韦（ETV）、替比夫定（LDT）和替诺福韦（TDF）。LAM和ADV是CHB治疗的一线药物。大部分情况下，CHB的治疗使用单个NRTIs在短期内可快速抑制HBV复制，但长期使用，由于药物耐药HBV株的出现，会出现一种不佳的治疗效应，药物耐药作为治疗失败的最重要的因素出现。NRTIs治疗失败带来一个重要的临床挑战，限制了后续治疗的选择范围，因此抗病毒药物耐药受到广泛关注。ADV是一个对HBV野生株和LAM耐药株均有效的核苷类似物，在LAM补救治疗中起重要作用。ADV耐药出现比LAM耐药晚，但在LAM治疗失败的患者中，阿德福韦酯治疗时耐药性的发展非常迅速。单一氨基酸的变化，rtN236T和/或rtA181V/T置换，均足以导致ADV临床治疗失败，是ADV耐药的典型位点。其他与ADV治疗失败有所关联的逆转录区序列位点改变，包括rtL80V/I、rtV84M、rtV214A、rtS85A、rtQ215S、rtE218G、rtP237H和rtN238T/D/H，可单独出现或联合rtN236T与rtA181V/T出现。HBV多聚酶改变在ADV治疗失败中仅仅在少数的临床分离中被检测出，怀疑有更多的未知因素造成阿德福韦酯临床耐药。影响NRTIs治疗应答和耐药发生的因素很多，HBV基因型是常见被报道的因素之一。很多研究的结果也有所差异。目前普遍认为HBV基因型对耐药的出现和耐药突变的类型有一定的影响。LAM的耐药突变YMDD与HBV基因型相关的报道较多，认为HBV基因型对YMDD突变发生率没有太大的影响，但影响YIDD/YVDD变异的类型。在ADV治疗中，有研究者认为其耐药突变的发生率在基因型A和D患者中无明显差异，也有研究者认为ADV的耐药或许主要出现在B和D基因型中。目前尚有争议。HBV自然变异速率较RNA低，而核苷类似物干预加速了病毒变异，并特异性选择逆转录酶区。HBV在阿德福韦酯干预下出现的变异是否会打破与宿主长期共进化的免疫平衡，导致细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）表位的变化，从而与肝炎的发作相关。目前有报道认为RT区的变异能够引起免疫反应的变化，如rtM204I基础上联合rtL180M变异可能导致突破后肝炎，但相关的研究还较少，特别是对ADV耐药变异带来的免疫影响。由于ADV基因耐药患者出现较少，对该类患者的研究样本普遍偏小，多为研究ADV应答效果的附带结果，本研究花长时间收集了较大的样本量，更详细的分析ADV临床应答不佳的原因和耐药突变类型与HBV基因型以及其他临床因素的关系，特别是rt181的变异类型的影响因素及对HBsAg的影响，目前国内外尚缺乏相关资料。本实验在此基础上进一步研究ADV耐药株的表位漂移情况。结果1.161例ADV临床耐药的CHB患者进行了RT区测序，135例患者为ADV治疗中出现病毒反弹患者，26例为ADV早期不应答患者。在发生病毒学反弹患者中，ADV基因耐药组的年龄42.20±7.99岁，和ADV治疗疗程30.01±11.03月，均比无基因耐药组高（年龄33.57±9.69岁，治疗疗程19.97±10.86月）（P=0.000），无基因耐药组HBeAg阳性率85.2%高于基因耐药组56.8%（P=0.000）。ADV早期无应答患者大多（24/26）未检出基因耐药（P=0.000）。其中在74例ADV治疗过程中发生病毒学反弹并检测出基因耐药的患者中，有19例同时发生rt181+rt236变异，余55例为单一rt181或者rt236位点变异患者，将发生不同基因耐药位点突变的12个可能影响因素进行单因素分析和多因素回归分析，HBV基因分型和合并肝硬化影响两个位点的选择（P=0.002和P=0.026）。 Rt236位点变异组中88.9%为基因型B，与重庆地区HBV基因型的分布及ADV临床耐药、基因耐药、rt181变异组差异显着（P＜0.05）。在48例ADV治疗过程中发生病毒性反弹和检测出rt181位点变异的患者中，将可能影响rtA181T、rtA181V变异类型的选择因素进行单因素分析和多因素回归分析，rtN236T变异和ADV治疗疗程均为rt181位点突变类型的影响因素（P=0.007，P=0.024）。RtN236T变异与rtA181T同时出现更为常见。出现rtA181V变异患者的治疗疗程要长于rtA181T患者。2.161例接受ADV治疗并发生临床耐药患者，rt238位点为N氨基酸者共46例，占28.6%，为H的有105例，占65.2%，为T的9例，占5.6%，另有1例为罕见的rtN238Q。在基因耐药和无基因耐药患者中，HBV氨基酸序列的rt238位点氨基酸差异无统计学意义（P=0.709）。Rt238的三种不同类型氨基酸在HBV基因型中差异显着（χ2=83.874，P=0.000）。RtN238H主要出现在基因型B患者中，rtN238主要出现在基因型C患者中，而rtN238T的HBV序列全部为基因型C。Rt238的氨基酸类型在ADV突变的三种模式rt181、rt236、rt181+rt236中有显着差异（χ2=25.640，P=0.000）。采用偏相关分析，控制HBV基因型，rt238氨基酸类型与三种突变模式无明显相关（P=0.347）。在ADV单药治疗和LAM-ADV序贯治疗组中，rt238的氨基酸差异无统计学意义（χ2=1.262，P=0.532）。且在6例ADV治疗患者治疗前后，rt238位点的氨基酸均无变化，其中有2例为rtN238H，4例为rtN238。对照52例LAM耐药和26例未经治疗的CHB患者，rt238位点氨基酸类型分别在LAM组和未经治疗的野生株中分布与HBV基因型均有关（P=0.000）。HBV基因型在未经治疗患者中与LAM单药耐药组的差异有统计学意义（χ2=8.751，P=0.003），而与ADV单药耐药组无显着差异（χ2=0.573，P=0.449）。Rt238位点的氨基酸类型在未经治疗组、LAM单药耐药组、ADV单药耐药组中分布无显着差异（P=0.326）。3. LAM单药诱导rt181变异的7例患者中，以rtA181T为主，有5例，占71.4%，ADV单药诱导的15例rt181变异患者中，8例是rtA181V型，7例rtA181T，两组间的差异无统计学意义（χ2=4.139，P=0.067）。比对两治疗组患者的序列，发现rt223位点氨基酸类型与治疗组有关，在两个治疗组间有统计学差异（χ2=5.455，P=0.020），在ADV治疗组中，rtA223有12例，占80%，在LAM治疗组中，rtS223有5例，占71.4%。采用偏相关分析，控制HBV基因型的影响，rt223位点氨基酸类型同样与治疗组存在正相关关系（P=0.013）。在不同基因型中rt221、rt223、rt224、rt238位点的氨基酸类型均有统计学差异（P=0.001；P=0.010；P=0.035；P=0.011）。4.在15例rt181变异发生后的血清中，在不同基因型中HBsAg差异显着（P=0.037），HBsAg半定量在7例基因型B患者中为8341.57±1510.01S/COI，在8例基因型C患者中为5688.05±2651.79S/COI。同时发生rt236变异的血清中HBsAg水平明显高于无rt236变异患者（P=0.008）。两例rt181不同变异类型患者多个变异前后时相点分析，发生rtA181T变异的患者,发生变异时，HBsAg的升高幅度较小。发生rtA181V变异的患者，各个时相点的HBV DNA对数值与HBsAg之间显着相关（P=0.001），发生变异时相点HBV DNA与HBsAg的变化趋势相反。5.2例ADV耐药的HLAA2型患者进行治疗前后的HBV全序列表位预测。两例患者均在强抗原性区域LHB346-354、LHB382-390、 LHB388-396出现了氨基酸的改变。针对LHB346-354表位的变化，本研究利用来源于蛋白质晶体结构数据库的HLA-A2计算机分子模型，对变异前后的3条表位肽与HLA-A2的结合情况进行了分子动力学模拟，变异后表位WFSLLVPFV与MHC分子形成了更强的氢键作用。三个肽与MHC分子间亲和力由大到小为WFSLLVPFV＞WLSLLVPFV＞RLSLLVPFV。LHB346-354、LHB382-390、 LHB388-396三个表位变异前后九肽进行CTL细胞表位功能验证，检测的表位肽均高于阴性对照，2号患者的LHB346-1表位甚至高于阳性对照。2例HLAA*1101型ADV耐药患者，预测X87-95是CTL表位的可能性大。LHB346-354表位未预测出，将该表位与MHC分子对接（HLAA*1101），发现WFSLLVPFV与MHC分子也有较强的亲和性。结论1. ADV临床耐药患者中大多无ADV基因耐药突变，提示除耐药突变外其他因素可能影响ADV应答。2.通过比较rt181和rt236位点单一变异的ADV治疗患者临床和病毒学因素，提示HBV基因型是选择ADV耐药突变位点的重要影响因素。3.首次提出rt181突变类型受ADV治疗疗程和rt236位点变异的影响。RtN236T在rtA181T突变患者中更为常见，rtA181T突变在ADV治疗中出现较rtA181V早。4. RtH238是重庆地区常见的病毒株，与治疗无关，与HBV基因型B有关。5. LAM单药诱导的rt181位点变异以rtA181T为主，ADV单药诱导的rt181变异以rtA181V为主。6.首次发现在不同药物诱导的rt181变异患者中，rt223位点氨基酸类型与治疗药物有关，提示其可能影响病毒对核苷类似物的应答。7. Rt221、rt223、rt224、rt238位点均为HBV基因型依赖位点。8. HBsAg滴度与HBV DNA水平相关，rt181耐药突变在一定程度上影响HBsAg的表达。9. LHB346-354、LHB382-390、 LHB388-396经预测和验证为HLAA2的CTL细胞表位，且易于在ADV治疗中出现氨基酸置换，从而影响免疫应答。10. LHB346-354（重叠rt181变异位点）分子模拟提示也是HLAA11的CTL细胞表位。
郭艳[7]（2011）在《CD8+T细胞免疫压力对丙型肝炎病毒进化的影响》文中进行了进一步梳理目的已有文献报道丙型肝炎病毒（HCV）感染过程中CD8+ T细胞免疫压力可以导致病毒变异的出现。但是,这种免疫适应过程在群体水平上对于病毒进化的影响还不是很清楚。在本研究中我们利用44例慢性丙型肝炎患者研究病毒NS3区的适应过程,初步筛查湖北地区HCV流行株中CD8表位的适应性变异情况。方法分离了69例HCV感染患者体内的病毒,以巢式PCR对HCV NS3区进扩增并测序,同时对18条全长HCV NS3区的已知CD8表位区内部及外部的突变位点进行分析。此外,还分析了不同HLA-Ⅰ限制性免疫压力作用下位点的变异情况。结果在已知CD8表位内部的突变频率明显高于表位外部。我们通过对测序结果的比对分析发现在NS3区的631个氨基酸中有7个（V1274I/T:95%;Y1444F:68%;T1636I:63%;S1148G:76%;L1382I:75%;S1560G:56%;A1647T:40%）突变频率较高的氨基酸残基。有意义的是,7个氨基酸残基中有5个（V1274I/T:95%;Y1444F:68%;T1636I:63%;S1148G:76%;L1382I:75%;）位于CD8表位内部。群体水平上, HLA等位基因频率较高的人群其相应的限制性CD8表位突变频率相当高,这就提示群体水平上免疫压力的重现性（即在拥有同种HLA等位基因的群体中,免疫压力可以持续作用于该表位,促使该突变表位在群体中累积下来）。结论CD8+T细胞免疫压力对丙型肝炎病毒进化有重要的影响,HLA-Ⅰ相关的选择性压力是病毒NS3进化的主要驱动力。群体水平上HCV对CD8+ T细胞免疫压力的适应使疫苗的设计更加复杂化。本课题的创新点1.基于欧洲人群与中国人群HLA等位基因频率不同,我们检测中国人群中频率较高的HLA等位基因相应限制性表位的变异情况,进一步分析CD8表位变异与HLA多态性的相关性。2.国内既往多项研究集中关注于HCV变异与CTL表位关系的研究,仅少数关于HLA-I类限制性等位基因与HCV变异关系的研究。本课题研究的意义1.明确分析病毒基因组变化对于评价免疫选择压力在病毒进化方面发挥的作用有很重要的意义。2.对于HCV中HLA等位基因表达与病毒序列多态性关系的测定可以为丙肝慢性化的可能机制提供一个更深的见解,这些结果对于以T细胞为基础的疫苗的有效靶点的选择具有很重要的影响。
任玉林,张宇,邱立鹏,张小俊,陈煜,王福生,谢尧,高斌,段钟平,孟颂东[8]（2010）在《新型HLA-A2限制的B,C型HBV特异性CTL表位的筛选及鉴定》文中提出乙型肝炎病毒（HBV）特异性CD8+T细胞（CTL）介导的细胞免疫应答在控制HBV感染和病毒清除中至关重要,已鉴定的T细胞表位绝大多数都来自A,D基因型的乙肝病毒,而在我国流行的B,C型病毒表位研究较少.本研究合成重叠九肽肽库,通过细胞结合试验和体外重折叠实验系统筛选和鉴定B型和C型HBV核心蛋白表位,发现一个在60位氨基酸由L变异成V（L60V）而产生的新表位HBcAg60-68.表位肽能在HLA-A2/Kb转基因小鼠体内激发特异性CTL细胞免疫反应.检测HLA-A2阳性乙肝患者表位特异性CTL证明该九肽序列为体内自然加工的表位,这为研究HBV感染中特异性CTL免疫应答提供新的依据.
李晓东[9]（2010）在《乙型肝炎患者HBV基因型/亚型的分析与临床意义研究》文中进行了进一步梳理背景:大量研究发现HBV基因型/亚型与病毒感染途径、基因突变、疾病进程和抗病毒疗效具有一定相关性,且不同地域和人群的基因亚型分布有显着差异。但在以往的研究中,HBV基因型和基因亚型分型的方法多采用PCR RFLP法,其检测结果受到限制性内切酶的功能状态、酶的反应条件及操作人员技术水平等影响较大,这些因素制约了PCR RFLP的检验效能。传统的PCR产物直接测序法获得的信息直观丰富,是基因亚型分型的金标准,但其敏感性较低,通常只有104 IU/ml水平,无论应用于临床检测还是科学研究都很难达到理想的效果。此外,我们在分析大样本量的序列数据时,发现采用人工判断和统计序列差异的方法工作量大、效率低,而国外已有的HBV序列分析数据库都以欧美流行的A型、D型、E型HBV序列为主,且很多数据库需要付费才能使用。目的:本研究拟建立高度敏感特异的HBV序列扩增方法,检测HBV RT全基因和前C区所有突变;建立HBV序列数据库,借助数据库的数据分析和汇总功能,分析2377例HBV序列的RT区耐药突变情况、前C/BCP突变情况、CTL表位变异情况,并对基因亚型B2和C2在乙肝相关疾病进展各个阶段的比例进行分析,从不同角度阐明HBV基因亚型与疾病转归的关系。内容:选取2007年7月至2008年12月于解放军302医院就诊的华北地区（北京、河北、山西、天津、内蒙古五省）2377例慢性HBV感染患者（男性1981例,女性396例;年龄38±13岁）,其中慢性乙肝（CHB）患者1874例,乙肝相关肝硬化（LC） 354例,慢加急性肝衰竭（ACLF） 32例,肝细胞癌（HCC） 117例。诊断标准均参照2000年9月（西安）全国会议修订的《病毒性肝炎防治方案》标准,排除乙丙重叠感染及HIV混合感染者。方法:提取慢性HBV感染患者血清HBV DNA,采用巢式PCR扩增前S/S基因和前C/BCP区基因,对PCR产物直接测序。根据测得前S/S基因序列构建系统进化树确定基因型/亚型。建立包含耐药突变分析、前C/BCP基因突变分析、CTL变异分析等多种生物信息学功能的HBV序列数据库,分析基因亚型B2和C2间,RT区耐药突变rtL80I、rtV84M、rtV173L、rtL180M、rtA181T、rtT184A/I/L/P/S、rtS202G、rtM204I/V、rtN236T、rtM250L的发生率差异;分析前C/BCP区T1753A/C/G、T1758C、A1762T、G1764A、C1766T、T1768A、G1862T、G1896A、G1899A的突变发生率差异;分析多聚酶区和表面抗原区CTL特异性表位变异频率和变异类型差异;分析基因亚型B2和C2病毒在不同进程病情患者中的分布频率。结果:1.建立了高效敏感的HBV序列扩增方法:通过对实验条件的不断优化,我们建立了高效、敏感的preS/S （包含RT全基因序列）区扩增方法,可同时检测HBV RT全基因和前C区所有突变;对RT耐药突变的检测敏感性达到了100 IU/ml,较国际公认测序法的敏感性（≥104 IU/ml）提高了2个数量级;克服了高病毒载量耐受的难题,可同时检测病毒载量相差1亿倍的样本。2.建立了大样本患者的HBV序列数据库:包含6800余例来自全国各地HBV感染患者的临床相关资料,11000余条HBV功能序列信息,并具有相似性检索、基因型分析、耐药位点分析、前C/BCP区分析、CTL表位分析等多种生物信息学分析功能。3.阐明HBV基因型/亚型在华北地区的分布情况:对2377例患者进行基因型/亚型分型,检出的HBV基因型有B、C、D三种,分别占83.8%（1992/2377）、15.5%（368/2377）和0.7%（17/2377）。基因亚型的例数与在所有患者中的比率为B1 10例（0.4%）,B2 344例（14.5%）,B3 6例（0.3%）,B4 8例（0.3%）,C1 28例（1.2%）,C2例1937 （81.4%）,C3例21 （0.9%）,C4 6例（0.3%）。B基因型中以B2占绝大多数（344/368,93.5%）; C型中以C2占绝大多数（1937/1992,97.2%）;未发现其它基因型。华北地区各省市之间HBV基因型/亚型分布特点类似。4.阐明HBV基因型/亚型与疾病转归的关系:a.不同基因亚型患者的性别比例、HBV DNA载量、ALT、AST、TBIL、CHE、PTA、PTT值之间的差别无统计学意义。b.拉米夫定（LAM）相关耐药突变位点rtL80I、rtV173L、rtL180M、rtM204I、rtM204V的突变发生率均为C2高于B2,除M204V位点外,其余位点突变率的差异均有统计学意义（P<0.05）;阿德福韦耐药和恩替卡韦耐药突变发生率并无明显差别（P>0.05）。c.基本核心启动子（BCP）区突变位点T1753A/C/G、T1758C、A1762T/G1764A、C1766T、T1768A的突变发生率均为C2亚型高于B2亚型,除T1768A外差异都有统计学意义（P<0.05）;前C区突变位点G1896A则为C2亚型低于B2亚型,差异有统计学意义（P<0.05）。d. S区有5个CTL表位在基因亚型B2和C2之间的变异发生频率不同:preS2 44-53、S 14-22、S20-28、S88-96、S172-180,且其差异都有显着的统计学意义（P<0.05）;P区Pol 455-463表位在基因亚型B2和C2间的变异发生频率不同,其差异有显着的统计学意义（P<0.05）。B2和C2亚型间各个CTL表位的变异类型也有很大区别,如B2亚型病毒S 38-47表位的变异类型主要为SLNFLGGTPV,而C2亚型则主要为SLNFLGGAPT;B2亚型S207-216表位的变异类型主要为NILSPFMPLL,C2亚型则为NILSPFLPLL。e.随着患者病情以AHB→CHB→LC→ACLF→HCC的顺序逐步发展,C2亚型在各组患者间的比例逐渐增大,在AHB患者中C2:B2患者例数比例为1.7,CHB患者中为5.7,LC患者中为7.5,ACLF患者中为8.0,HCC患者中为15.3。结论:建立了以我国HBV患者流行的B型和C型为主、包含完整患者资料、大量序列信息和多种生物学功能的序列数据库。我国华北地区流行的HBV病毒以C型和B型为主,D型也有少量分布;其中C2和B2为主要亚型,占患者总数的95.9%。B2和C2两种基因亚型病毒感染患者间的耐药突变发生率有一定差异,LAM相关耐药位点的突变发生率为C2亚型高于B2亚型,而ADV和ETV耐药相关位点的突变发生率无明显差异;BCP区突变率为C2亚型高于B2亚型,但前C区的G1896A位点为B2亚型高于C2亚型;各CTL表位B2和C2亚型变异发生频率和变异形式都有很大差异。总体来讲,C2型HBV感染转B2型HBV感染更易向慢性化发展,并更易引起慢性肝炎的重症化。
郝燕[10]（2009）在《HBV前C/BCP区基因突变及血清sHLA-Ⅰ水平与慢性HBV感染的相关性》文中研究说明研究背景:乙型病毒性肝炎是常见的感染性疾病之一,在世界各地均有不同程度的流行,目前世界约有3.5亿人为慢性乙型肝炎（CHB）。慢性乙型肝炎是一种潜在的进展性致死性疾病,据世界卫生组织资料显示,乙肝已成为人类第九大死因。我国是乙型病毒性肝炎的流行大国,其中HBV携带者约占人口的10%,即1.2亿人,约占世界乙肝病毒携带者的1/3,而携带者中又有约15%～40%的感染者发展为不同类型的肝病,如活动性肝炎、肝硬化、甚至原发性肝癌,而我国乙肝的发病率还呈持续上升趋势。机体感染HBV后的临床结局,多数人认为是由病毒、肝细胞和宿主免疫系统相互作用决定的。HBV基因突变是影响病毒生物学特性的基本因素之一,HBV基因突变有可能改变病毒的复制能力和致病性、改变抗原表位而影响免疫应答,进而可能造成严重的肝细胞损伤等。研究表明前C/BCP（基本核心启动子）区突变可影响HBeAg的表达/分泌,认为分泌型HBeAg与HBcAg有共同的抗原表位,可以减缓细胞毒T淋巴细胞（ CTL）对表达HBcAg的肝细胞的攻击,故而该区突变不利于免疫耐受,与慢性肝炎的病情加重有关。但对上述观点也存在争议。人白细胞抗原Ⅰ类分子（Human leucocyte antigenⅠ,HLA-Ⅰ）是由人类主要组织相容性复合体编码的一类糖蛋白,广泛存在于有核细胞表面。HLA-Ⅰ抗原在免疫系统中起关键作用,是参与机体特异性免疫反应的主要分子。正常人肝实质细胞HLA-Ⅰ表达甚微或基本不表达,当HBV感染后,肝细胞上HLA-Ⅰ表达异常。血清可溶性HLA-Ⅰ分子（soluble HLA-Ⅰ,sHLA-Ⅰ）与组织HLA-Ⅰ分子有共同的多态特异性决定簇。sHLA-Ⅰ在正常人血清中的含量很低且相对恒定,HBV感染后,血清sHLA-Ⅰ水平明显升高。本文就HBV前C/BCP区突变和机体sHLA-Ⅰ水平解析他们与慢性HBV感染病情发展的关系;并研究他们二者的相关性。研究对象:本实验以在汾阳医院就诊的吕梁地区慢性HBV感染患者为研究对象。目的:（1）比较三种HBV DNA提取方法对PCR产物量的影响。（2）探讨HBV前C/BCP基因突变和血清sHLA-Ⅰ与慢性HBV感染的发生、发展及转归的关系,并从机体免疫角度研究HBV基因突变对sHLA-Ⅰ水平的影响。方法:（1）采集山西医科大学附属汾阳医院就诊的HBsAg阳性的血清133例和健康体检者的血清20例,均于清晨空腹静脉采集,收集临床资料。（2）模板制备:分别用碱裂解法、直接煮沸法、裂解液煮沸法抽提患者血清中HBV DNA,比较所得DNA条带的阳性率、光密度值,寻找合适的模板提取方法。（3）采用巢式PCR法扩增,HBV前C/BCP区基因组不同区段分别设计两套引物,增加实验的灵敏度。（4）采用限制性片断长度多态性（RFLP）分析方法,对PCR产物进行酶切分析,确定HBV的突变型、野生型和混合型。为证实该方法的准确性,随机挑取一些PCR产物测序。（5）采用ELISA技术测定健康体检者和HBV感染者血清sHLA-Ⅰ水平。（6）统计学处理采用SPSS 13.0版统计软件。结果:（1）在3种不同的DNA抽提方法中,碱裂解法所得DNA条带亮度与条带面积均较好,阳性率高,模板量多,与其它组比有显着差异（P<0.01）。（2）本地区HBV感染人群BCP T1762A1764双突变率58.2%,PreCA1896突变率15.2%,两组间突变率比较有显着差异（P<0.001）。（3）HBeAg的表达与BCP双突变有显着相关性（P<0.01）,与前C区A1896突变无明显相关性（P>0.05）。前C区A1896突变或BCP双突变从总体上与病情的发展有显着关系（P<0.05;P<0.01）,但在慢性肝炎轻度、慢性肝炎中度和肝硬化组之间无显着差异（P>0.05）。（4）血清sHLA-Ⅰ水平在慢性肝炎患者的含量明显高于正常对照（P<0.01）;并且随慢性肝炎病变加重有逐渐增加的趋势,但无统计学意义（P>0.05）;无症状携带者组其含量也高于正常对照组,但差异无统计学意义（P>0.05）。（5）血清sHLA-Ⅰ表达与前C或BCP突变有关,突变组sHLA-Ⅰ表达明显增加,与正常组和未突变组相比有显着意义（P<0.05）。（6）将入选标本分为HBeAg（+）组和HBeAg（-）组,血清sHLA-Ⅰ水平在e抗原阴性患者中表达较低,但两组之间比较无显着差异（P>0.05）。结论:（1）碱裂解法在血清HBV DNA抽提中的效果最好。（2）慢性乙肝患者更容易发生BCP双突变,前C/BCP突变与乙肝病情发展有关。BCP区变异可作为携带者随访的重要指标, BCP区一旦有双突变发生,将预示病情会有发展。（3）前C/BCP区突变影响患者的免疫功能。肝脏细胞的损害会导致sHLA-Ⅰ的释放,sHLA-Ⅰ的水平与乙型肝炎的发展有关。
二、HLA-肽复合物研究HBV/C区变异对HLA-A2限制性表位的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、HLA-肽复合物研究HBV/C区变异对HLA-A2限制性表位的影响（论文提纲范文）
（1）藏族人群HBV准种变异特征及其HLA限制性研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 第三代测序用于HBV准种分析的方法学研究 |
| 2.1 研究对象及材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 藏族人群HBV准种变异特征研究 |
| 3.1 实验材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 藏族人群HBV准种HLA限制性研究 |
| 4.1 实验材料和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 HBV准种变异及其HLA限制性研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（2）HIV和HBV病毒蛋白同宿主细胞的相互作用机制研究（论文提纲范文）
| 本研究的创新点 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 人类免疫缺陷病毒Nef蛋白调控Fas凋亡通路的分子机制 |
| 1 研究背景 |
| 1.1 HIV及调控蛋白Nef |
| 1.1.1 HIV基因组 |
| 1.1.2 Nef的特点 |
| 1.1.3 Nef对表面受体的调控 |
| 1.1.4 Nef对信号通路的调控 |
| 1.2 细胞凋亡的信号途径 |
| 1.2.1 死亡受体介导的凋亡信号通路 |
| 1.2.2 内质网介导的凋亡信号通路 |
| 1.2.3 线粒体介导的凋亡信号通路 |
| 1.3 细胞色素B与细胞凋亡 |
| 2 试剂与材料 |
| 2.1 菌株、质粒与细胞 |
| 2.2.1 菌株、细胞与动物 |
| 2.2.2 质粒 |
| 2.2 文库、试剂及抗体 |
| 2.2.1 试剂 |
| 2.2.2 培养基、诱导剂及文库 |
| 2.2.3 抗体 |
| 2.3 溶液的配制 |
| 3 研究方法 |
| 3.1 酵母双杂交筛选 |
| 3.1.1 测定文库的滴度 |
| 3.1.2 扩增酵母文库 |
| 3.1.3 酵母菌的活化 |
| 3.1.4 小量转化诱饵蛋白质粒 |
| 3.1.5 文库质粒的转化 |
| 3.1.6 诱饵蛋白自身激活检测 |
| 3.1.8 酵母质粒的提取 |
| 3.1.9 DH5α感受态制备及质粒转化 |
| 3.2 重组质粒的构建 |
| 3.2.1 质粒的小量提取 |
| 3.2.2 限制性酶消化 |
| 3.3.3 用试剂盒回收DNA |
| 3.3.4 DNA片段和载体的连接 |
| 3.3 细胞培养和转染 |
| 3.3.1 细胞传代 |
| 3.3.2 细胞的转染 |
| 3.4 凋亡检测 |
| 3.5 多克隆抗体的制备 |
| 3.5.1 Cyto b免疫抗原的表达纯化 |
| 3.5.2 多克隆抗体的制备 |
| 3.6 线粒体的纯化 |
| 3.7 HIV-1BA-L假病毒的制备 |
| 3.8 免疫共沉淀实验 |
| 3.9 Western Blot实验 |
| 4 研究结果 |
| 4.1 Nef能直接与Cyto b结合 |
| 4.1.1 酵母双杂交结果 |
| 4.1.2 Cyto b与 Nef能产生体内的相互作用 |
| 4.2 胞质中的Cyto b参与了Fas凋亡通路 |
| 4.2.1 Cyto b免疫抗原的制备 |
| 4.2.2 Fas刺激后引起Cyto b的切割和C端从线粒体的释放 |
| 4.3 Nef抑制了Fas介导的细胞凋亡 |
| 4.4 Fas凋亡信号诱导Nef与 Cyto b的结合 |
| 4.5 Nef抑制了Cyto b介导的Fas凋亡途径 |
| 4.6 Nef是 Cyto b介导的Fas凋亡通路的抑制子 |
| 4.7 Nef也参与抑制了Cyto c介导的Fas凋亡途径 |
| 4.8 HIV感染细胞后,FasL诱生Cyto b的释放有所增强 |
| 5 结果讨论 |
| 第二章 乙型肝炎病毒核心抗原HBc抑制干扰素α诱导IFITM1 表达的分子机制 |
| 1 研究背景 |
| 1.1 HBV及核心蛋白HBc |
| 1.1.1 HBV基因组 |
| 1.1.2 HBV与肝癌 |
| 1.1.3 HBc及其功能 |
| 1.2 IFN及其诱导的信号通路 |
| 1.2.1 干扰素的分类 |
| 1.2.2 干扰素的生物学作用 |
| 1.2.3 IFN诱导的信号通路 |
| 1.3 SWI/SNF家族 |
| 1.3.1 SWI/SNF的功能 |
| 1.3.2 BAF200 |
| 1.4 IFITM家族 |
| 1.4.1 IFITM家族的特点 |
| 1.4.2 IFITM1 及其功能 |
| 2 试剂与材料 |
| 2.1 菌株、质粒与细胞 |
| 2.1.1 菌株与细胞 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.2 文库、试剂及抗体 |
| 2.2.1 试剂 |
| 2.2.2 培养基、诱导剂及文库 |
| 2.2.3 抗体 |
| 3 研究方法 |
| 3.1 RNA干扰试验 |
| 3.2 RT-PCR |
| 3.2.1 RNA提取所用器具的处理 |
| 3.2.2 细胞总m RNA的提取 |
| 3.2.3 RNA电泳检测 |
| 3.2.4 RNA的反转录 |
| 3.3 细胞活力检测 |
| 3.4 ELISA 实验 |
| 3.5 荧光定量PCR |
| 4 研究结果 |
| 4.1 HBc与 BAF200 的相互作用 |
| 4.1.1 酵母双杂交结果 |
| 4.1.2 HBc与 BAF200 存在体内的相互作用 |
| 4.2 BAF200 调控IFNα诱导的IFITM1 的表达 |
| 4.3 HBc通过与BAF200 相互作用抑制IFITM1 的转录 |
| 4.4 HBc与 BAF180 竞争性结合BAF200,破坏PBAF复合体的形成,进而削弱了BAF200对IFITM1 的表达调控 |
| 4.5 IFNα的诱导不影响STAT1 的磷酸化水平 |
| 4.6 HBc削弱BAF200 对细胞活性的影响 |
| 4.6.1 BAF200 通过IFITM1 对细胞活力进行影响 |
| 4.6.2 HBc可以削弱BAF200 对细胞活力的影响 |
| 4.7 IFNα诱导下BAF200和HBc对 HBV复制水平的影响 |
| 5 结果讨论 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的与学位论文相关的科研成果 |
| 致谢 |
（3）乙型肝炎病毒特异性CTL表位变异分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 病例来源和DNA分离 |
| 1.2.2 PCR扩增目的片段 |
| 1.2.3 目的基因测序 |
| 1.2.4 HBV基因分型 |
| 1.2.5 序列分析 |
| 1.2.5 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 PCR测序结果及HBV基因型的判定 |
| 2.2 CTL表位序列变异差异分析 |
| 3 讨论 |
（4）猪MHCI晶体结构及结合IAV和PRRSV表位特性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 国内外研究进展 |
| 1.2 研究目的及意义 |
| 1.3 研究内容与技术路线 |
| 1.4 研究目标 |
| 第二章 猪SLA Ⅰ基因克隆及多态性分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.3 方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 猪SLA Ⅰ优势基因的筛选及表达 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.3 方法 |
| 3.4 结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 黑山猪pSLA-3*hs0202晶体结构与递呈抗原多肽特征 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料 |
| 4.3 方法 |
| 4.4 结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 结论 |
| 第五章 藏香猪SLA-1*0501晶体结构及递呈PRRS病毒表位的研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料 |
| 5.3 方法 |
| 5.4 结果 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 结论 |
| 第六章 结论和创新点 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）AFP158-166特异性TCR转基因T细胞治疗肝癌的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、AFP_(158-166)特异性TCR转基因T细胞的构建 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 筛选基因分型HLA-A0201健康志愿者 |
| 1.2.2 建立AFP_(158-166)特异性T细胞克隆 |
| 1.2.3 克隆AFP_(158-166)特异性TCRα和TCRβ基因,构建表达特异性TCR的慢病毒载体 |
| 1.2.4 体外制备并扩增AFP_(158-166)特异性TCR转基因T细胞 |
| 1.2.5 AFP_(158-166)特异性TCR转基因T细胞功能检测 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 肝细胞肝癌的生物治疗 |
| 1.3.2 AFP在肝细胞肝癌诊治中的意义 |
| 1.3.3 人树突细胞的培养与生物学功能 |
| 1.3.4 抗原特异性T细胞的激活增殖与检测分离 |
| 1.3.5 TCR多样性及AFP_(158-166)抗原特异性TCR基因克隆 |
| 1.3.6 AFP_(158-166)特异性TCR转基因T细胞的体外制备和功能检测 |
| 1.4 小结 |
| 二、AFP_(158-166)抗原肽与IL-15协同表达人工抗原递呈细胞的构建 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 流式细胞术鉴定BJAB细胞表型 |
| 2.2.3 辐照对BJAB细胞表型,增殖及存活影响 |
| 2.2.4 质粒CS-CDF-EF-1-afpIL15-PRE(JA15)浓度 |
| 2.2.5 质粒CS-CDF-EF-1-afpIL15-PRE(JA15)的鉴定 |
| 2.2.6 质粒CCS-IL15-Lv201的鉴定 |
| 2.2.7 荧光倒置显微镜评估细胞转染情况 |
| 2.2.8 FCM评估细胞转染情况 |
| 2.2.9 ELISA检测BA15对IL-15表达 |
| 2.2.10 BA15对eGFP,IL-15与AFP158-166抗原肽的稳定表达 |
| 2.2.11 BA15体外刺激AFP特异性T细胞克隆性增殖 |
| 2.2.12 AFP特异性T细胞对AFP~+肝癌细胞特异性杀伤作用 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 人工抗原提呈细胞与肿瘤特异性T细胞过继性免疫治疗 |
| 2.3.2 IL-15与肿瘤特异性T细胞过继性免疫治疗 |
| 2.3.3 AFP抗原与IL-15协同表达人工抗原递呈细胞的构建和鉴定 |
| 2.4 小结 |
| 三、AFP_(158-166)特异性转基因T细胞过继性免疫治疗的实验研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 体外实验 |
| 3.2.2 体内实验 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 肿瘤特异性TCR转基因T细胞免疫治疗进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（6）阿德福韦酯耐药模式及其免疫选择特性研究（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 阿德福韦酯耐药模式及影响因素分析 |
| 第一节 影响阿德福韦酯主要耐药模式的临床因素分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二节 RtN238H 在阿德福韦酯耐药株中的流行 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 不同药物诱导的 rt181 变异类型及对 HBsAg 的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 阿德福韦酯耐药株的全序列 CTL 细胞表位预测及验证 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 创新点、不足与展望 |
| 致谢 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 文献综述 乙型肝炎病毒基因型研究现状及与变异的关系 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的文章 |
（7）CD8+T细胞免疫压力对丙型肝炎病毒进化的影响（论文提纲范文）
| 中英文缩写名词对照表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）新型HLA-A2限制的B,C型HBV特异性CTL表位的筛选及鉴定（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 HBV核心蛋白来源的多肽与HLA-A2分子的结合 |
| 2.2 多肽表位最小序列的优化 |
| 2.3 HLA-A2轻链β2m、表位肽及HLA-A2重链体外重折叠实验 |
| 2.4 HBcAg60-68突变肽能刺激HLA-A2/Kb转基因小鼠产生特异性的CTL |
| 2.5 乙肝患者体内表位特异性CTL的检测 |
| 3 讨论 |
（9）乙型肝炎患者HBV基因型/亚型的分析与临床意义研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 HBV 前S/S 和前C/BCP 基因序列扩增和测定 |
| 一、对象与方法 |
| 二、结果 |
| 第二部分 HBV 序列数据库的建立 |
| 一、对象与方法 |
| 二、结果 |
| 第三部分 HBV 基因亚型分型及其在华北地区的分布 |
| 一、对象与方法 |
| 二、结果 |
| 第四部分 HBV 基因亚型分型及其与临床转归的关系 |
| 一、对象与方法 |
| 二、结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 主要仪器设备 |
| 相关综述1 |
| 相关综述2 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（10）HBV前C/BCP区基因突变及血清sHLA-Ⅰ水平与慢性HBV感染的相关性（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语表 |
| 正文 |
| 前言 |
| 第一章 抽提血清 HBV DNA 三种不同方法的比较 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二章 HBV 前 C/BCP 区基因突变与临床意义 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三章 HBV患者血清HLA-Ⅰ的检测与临床意义 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 总结 |
| 课题后续工作 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
四、HLA-肽复合物研究HBV/C区变异对HLA-A2限制性表位的影响（论文参考文献）
- [1]藏族人群HBV准种变异特征及其HLA限制性研究[D]. 蔡林. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [2]HIV和HBV病毒蛋白同宿主细胞的相互作用机制研究[D]. 李彤亚. 武汉大学, 2019(06)
- [3]乙型肝炎病毒特异性CTL表位变异分析[J]. 邹淑慧,肖九长,张丽琴,唐金凤,刘奕红. 实验与检验医学, 2016(05)
- [4]猪MHCI晶体结构及结合IAV和PRRSV表位特性的研究[D]. 樊淑华. 中国农业大学, 2016(05)
- [5]AFP158-166特异性TCR转基因T细胞治疗肝癌的实验研究[D]. 孙龙昊. 天津医科大学, 2014(01)
- [6]阿德福韦酯耐药模式及其免疫选择特性研究[D]. 周霞. 第三军医大学, 2012(11)
- [7]CD8+T细胞免疫压力对丙型肝炎病毒进化的影响[D]. 郭艳. 华中科技大学, 2011(07)
- [8]新型HLA-A2限制的B,C型HBV特异性CTL表位的筛选及鉴定[J]. 任玉林,张宇,邱立鹏,张小俊,陈煜,王福生,谢尧,高斌,段钟平,孟颂东. 科学通报, 2010(30)
- [9]乙型肝炎患者HBV基因型/亚型的分析与临床意义研究[D]. 李晓东. 中国人民解放军军事医学科学院, 2010(04)
- [10]HBV前C/BCP区基因突变及血清sHLA-Ⅰ水平与慢性HBV感染的相关性[D]. 郝燕. 山西医科大学, 2009(03)