大豆慢生型根瘤菌突变体库构建及参与环境胁迫相关基因的挖掘

论文摘要

豆科植物-根瘤菌共生固氮系统是生物固氮中效率最高的体系,无论对全球氮生态循环还是农业都极为重要。自然或农业生产条件下,豆科植物-根瘤菌共生固氮系统会不断遭受着逆境胁迫。长期以来,研究多集中在可控环境下的根瘤菌结瘤与固氮机制,以及豆科植物或者根瘤菌单方面对逆境的生理生化响应过程。作为具有紧密共生关系的根瘤菌是否以及如何帮助植物宿主抵抗不良环境仍然不清楚。深入理解大豆慢生型根瘤菌在大豆应答干旱胁迫伤害,适应性变化等过程中的生物学作用,对提高农业产量和保护生态环境具有非常重要的意义。本研究以大豆慢生型根菌Bradyrhizobium diazoefficiens USDA110为研究对象,采用Tn5转座诱变技术,建立突变体库,筛选胁迫环境条件型突变体,并初步探究了这些筛选突变菌株的生理生化、遗传以及共生特征。（1）探究了野生体B.d110在三种胁迫环境（pH、NaCl和干旱）条件下的生长模式,生长受到明显抑制（临界生长）时的胁迫条件分别是pH4.0、0.4%NaCl和12%PEG6000。以此为胁迫条件的大豆（绥农14号）接种实验结果显示,相较于非胁迫条件,无论接种与否,三种胁迫条件均显著降低了大豆的生物量（地上部和根部的干重）。但是,胁迫（pH和干旱）条件下,接种根瘤菌,显著增加了大豆的生物量。此外,三种胁迫条件下,接种根瘤菌后,大豆的叶片光合作用（最大光合和速率以及最大气孔导度）和对水分利用能力（最大蒸腾作用）均显著得到改善。结果表明,B.d110有助于大豆宿主抵抗不良环境。（2）为了探究B.d110帮助大豆抵抗环境胁迫的遗传背景,本研究利用Tn5转座诱变技术建立了3842个菌株的突变体库,并对库的特征做了初步鉴定。以体外临界生长胁迫环境为条件,筛选到生长具有明显差异的9株突变株。此外,利用Southern blot和Inverse-PCR的方法,对这些突变体菌株染色体上Tn5插入位点的单一性和精确位置进行了定位。（3）通过与野生株在菌落形态、运动性和生物膜和共生等方面的表型比较,发现其中两株（8-B6和8-H11）具有明显的共生差异,这两株突变分别造成了VirG双组份调控系统和Metal-bonding（Co）的插入突变。并进行了胁迫条件下的接种实验,实验结果显示:干旱条件下植株的根瘤数,生理以及固氮能力均不如正常条件接种的大豆植株。推断这两个基因可能与胁迫有关,还需进一步的验证。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 环境胁迫下的豆科-根瘤菌共生固氮
•   1.2 转座子在细菌功能基因研究中的应用
•     1.2.1 Tn5 转座子的特征
•     1.2.2 Tn5 转座子的作用机制
•     1.2.3 Tn5 突变体库的优点和应用
•   1.3 实验内容和目的、意义
•     1.3.1 实验内容和目的
•     1.3.2 研究意义
• 第二章 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 实验仪器
•     2.1.2 本研究所使用的菌株和质粒
•     2.1.3 本研究所使用的引物序列
•     2.1.4 培养基配制
•     2.1.5 溶液与缓冲液
•   2.2 常规的微生物操作
•     2.2.1 细菌的培养
•     2.2.2 表型检测
•   2.3 常规的分子生物学操作
•     2.3.1 细菌基因组DNA的提取
•     2.3.2 DNA的酶切
•     2.3.3 DNA的连接
•     2.3.4 聚合酶链式反应
•   2.4 大豆慢生型根瘤菌B.diazoefficiensUSDA110 体外临界胁迫条件的筛选
•   2.5 大豆慢生型根瘤菌B.diazoefficiens USDA110 突变体库的构建和质量分析
•     2.5.1 野生型菌株突变体文库的构建
•     2.5.2 突变体库质量的检测
•   2.6 突变体库的筛选
•   2.7 southern blot确定Tn5 插入突变体中的转座子插入数
•   2.8 Tn5 突变体插入位点的定位
•     2.8.1 Inverse-PCR
•     2.8.2 测序序列分析和插入位点定位
•   2.9 接种实验
•     2.9.1 普通接种实验的步骤
•     2.9.2 胁迫接种实验
•     2.9.3 半定量指标的测定
•     2.9.4 固氮酶活性测定——乙炔还原ARA法
• 第三章 结果和分析
•   3.1 干旱条件下,接种野生体大豆慢生型根瘤菌后,大豆的生理响应
•     3.1.1 野生体B.d110 在体外模拟胁迫条件（pH、NaCl、PEG6000）下的生长模式
•     3.1.2 B.d110 在胁迫条件下的接种实验
•     3.1.3 小结
•   3.2 日本慢生型大豆根瘤菌B.d110 的突变体库的构建
•     3.2.1 B.d110 的突变体库
•     3.2.2 B.d110的Tn5 突变体库特征分析
•   3.3 环境胁迫条件型突变菌株的筛选
•     3.3.1 野生株与条件型突变株的菌落形态
•     3.3.2 环境胁迫条件型突变菌株中Tn5 插入验证
•   3.4 Tn5 插入位点定位
•     3.4.1 Southern blot确定突变体插入次数
•     3.4.2 Inverse-PCR获取Tn5 插入位点的侧翼序列
•   3.5 环境胁迫条件型突变体菌株的表型
•     3.5.1 非胁迫条件下培养的菌落形态
•     3.5.2 野生株与突变株的运动性
•     3.5.3 生物膜形成能力
•   3.6 接种实验
•     3.6.1 非胁迫条件下,突变菌株与野生体菌株对大豆的接种影响
•     3.6.2 胁迫条件下,突变菌株与野生体菌株对大豆的接种影响
• 第四章 总结和讨论
•   4.1 总结
•     4.1.1 体外野生体B.d110 生长临界的胁迫条件以及接种后大豆生理响应
•     4.1.2 利用Tn5 转座子获得的大豆慢生型根瘤菌B.d110 插入突变体库
•     4.1.3 Tn5 插入突变体可表型的筛选和Tn5插入位点定位
•     4.1.4 接种实验
•   4.2 讨论
•   4.3 本文尚待解决的问题
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 韩芳

导师: 魏敏

关键词: 大豆慢生型根瘤菌,转座,诱变,环境胁迫,基因定位

来源: 兰州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,农作物

单位: 兰州大学

分类号: S565.1;Q939.114

总页数: 63

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