高效合成γ-氨基丁酸工程菌株的构建

论文摘要

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）是一种广泛存在于植物、动植物以及各种微生物体内的四碳非蛋白氨基酸,在食品、饲料以及化工行业中有着重要的作用。此外,GABA在人体大脑皮质、海马以及小脑中,是重要的抑制性神经递质。GABA是由谷氨酸在谷氨酸脱羧酶（L-glutamate decarboxylase,GAD）的作用下进行不可逆的α-脱羧形成的,筛选具有高活力的谷氨酸脱羧酶并解决合成过程中的酸性依赖的问题,对于优化用于工业生产的工程菌株具有重要意义。本研究基于前期高通量筛选获得的三个GAD突变体,利用亲和层析方法分别对GadBM1、GadBM4和GadBM8进行纯化,测定纯化后的各突变体在pH4.6和pH6.0条件下的脱羧酶活力。结果表明突变体GadBM4和GadBM1在两种不同条件下的酶活均有较大幅度提升,即在pH4.6时,突变体GadBM4和GadBM8的kcat/Km分别是原始蛋白（GadBM0）的1.40倍和1.31倍;而在pH6.0时,突变体GadBM4和GadBM1的kcat/Km值分别是原始蛋白的3.51倍和4.47倍。利用以上突变蛋白构建工程菌株,通过全细胞催化检测突变菌株的GABA合成情况,结果表明工程菌株BW（△）/pYBH-LbgadBM4的生产效率明显高于BW（△）/pYBH-LbgadBM1和BW（△）/pYBH-LbgadBM8,相比于出发菌株BW（△）/pYBH-LbgadBM0提高了67.08%,在转化到5 h时GABA浓度达289.90±7.11 g/L。结合酶学数据和转化效果,选择BW（△）/pYBH-LbgadBM4工程菌株用于后续实验,并命名为BW（△）/pYBH-LbgadB*。前期通过截短谷氨酸/γ-氨基丁酸逆向转运蛋白（GadC）,获得Gad（△）C突变蛋白,该蛋白的运输能力和pH活性范围明显提高。本实验通过超表达Gad（△）C以及调控因子GadW、GadX的编码基因,利用直接或者间接的方法进一步的上调Gad（△）C运输底物的功能,构建了4个工程菌株BW（△）/pYB-LbgadB*-linker-gad（△）C、BW（△）/pYB-LbgadB*-gad（△）C、BW（△）/pYB-LbgadB*-gadW和BW（△）/pYB-LbgadB*-gadX。全细胞催化结果显示,仅工程菌株BW（△）/pYB-LbgadB*-gadX合成GABA最高速率比出发菌株提高8.73%,其他工程菌株并未获得催化效率的显著提高。通过将伴侣蛋白和筛选得到的突变GadB*蛋白整合,构建工程菌株BW（△）/pYB-LbgadB*-gro。全细胞催化结果显示,该工程菌株GABA最高合成速率是出发菌株（72 g/L/h）的3倍,达到202 g/L/h,SDS-PAGE结果表明重组菌株中可溶性GAD明显增多;接着以经过乙酸合成途径敲除的SG104（BW25113ΔpoxB::acs）菌株为宿主细胞,构建工程菌株SG/pYB-LbgadB*和SG/pYB-LbgadB*-gro。全细胞催化结果显示,这两株工程菌合成GABA平均速率分别为64.82 g/L/h和73.87 g/L/h,较BW（△）作为宿主菌株提高了38.00%和10.50%。其中SG/pYB-LbgadB*全细胞催化反应到7 h后,GABA合成量为300.89±7.19 g/L,Glu残留仅为5 g/L左右。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 绪论
• 第一章 高酶活谷氨酸脱羧酶的筛选
•   第一节 材料与方法
•     1.1 实验材料
•     1.2 实验方法
•   第二节 结果与分析
•     2.1 GABA、Glu标准曲线的制作
•     2.2 His标签重组菌株的构建
•     2.3 GAD突变体的纯化
•     2.4 GAD酶动力学常数的测定
•     2.5 牛血清蛋白BSA标准曲线的绘制
•     2.6 GadB及其突变体动力学常数的测定
•     2.7 工程菌株的诱导培养
•     2.8 工程菌株的全细胞催化实验
•   第三节 小结与讨论
• 第二章 构建GadC突变菌株促进γ-氨基丁酸的合成
•   第一节 材料与方法
•     1.1 实验材料
•     1.2 实验方法
•   第二节 结果与分析
•     2.1 Gad（△）C过表达工程菌的构建与全细胞催化
•     2.2 通过GadW和 GadX调控基因组内Gad（△）C
•   第三节 小结与讨论
• 第三章 高产GABA工程菌株的构建
•   第一节 材料与方法
•     1.1 实验材料
•     1.2 实验方法
•   第二节 结果与分析
•     2.1 伴侣蛋白的表达
•     2.2 共表达伴侣蛋白工程菌株在SG104 宿主细胞的表达
•   第三节 小结与讨论
• 第四章 结论与展望
• 附录1
• 参考文献
• 致谢
• 索引
• 个人简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 夏可君

导师: 黄建忠

关键词: 氨基丁酸,谷氨酸脱羧酶,谷氨酸,氨基丁酸逆向转运蛋白,全细胞催化

来源: 福建师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 福建师范大学

分类号: Q93

DOI: 10.27019/d.cnki.gfjsu.2019.001760

总页数: 82

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