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生物合成10-HDA关键酶分子的克隆及工程菌构建研究

2020-12-08阅读(1040)

生物合成10-HDA关键酶分子的克隆及工程菌构建研究

论文摘要

10-羟基-2-癸烯酸（10-HDA）是一种同时具有双键、羟基的中链脂肪酸衍生物,仅存在蜂王浆中,具有抗菌、抗炎、免疫调节、神经调节、抗癌、抗肿瘤等作用,有很高的药用价值。目前10-HDA来源单一,直接提取法难以满足需求;化学合成法具有不可避免的缺点,比如:生产条件苛刻,易产生污染等,所以需要探求新的合成方法。分析其结构式可知羟基和双键是其中两个特殊的官能团,明确这两个官能团的形成过程对研究10-HDA的生物合成具有重要意义。本研究提出了构建10-HDA生物合成途径思路,即以癸酸为底物,在P450酶的作用下末端羟基化生成10-羟基癸酸,10-羟基癸酸在硫激酶的作用下加上辅酶A,然后在脂酰辅酶A脱氢酶的作用下在Cα和Cβ处脱掉两个氢原子形成反式双键,至此ω羟基和双键均形成。最后在硫酯酶的作用下脱掉辅酶A,形成10-HDA。（1）本实验首先克隆了四种来源的细胞色素P450酶:来自于巨大芽孢杆菌的细胞色素P450酶P450BM3,来自于枯草芽孢杆菌的细胞色素P450酶CYP102A1,来自于热带假丝酵母的细胞色素P450酶CYP52B1,来自于水酸杆菌Marinobacter aquaeloei的细胞色素P450酶CYP153A。构建了相应的工程菌E.coli(pET-21b-CYP153A-P450BM3M3 CPR)、E.coli（pET-28a-CYP102A1）、E.coli(pET-28a-P450BM3)、E.coli（pET-28a-CYP52B1-CPR）。（2）克隆了来自大肠杆菌的脂酰辅酶A硫酯酶ydiI,使用有助于小分子蛋白表达的载体表达该蛋白,构建了工程菌E.coli（pET-SUMO-ydiI）。（3）对构建的工程菌进行摇瓶发酵验证,利用静息细胞检测细胞色素P450酶的生物活性,最终只有工程菌E.coli(pET-21b-CYP153A-P450BM3M3 CPR)具有癸酸末端羟基化的能力;对脂酰辅酶A硫酯酶工程菌进行摇瓶发酵验证,结果表明该工程菌可以将癸烷转化为反式二癸烯酸,将10-羟基癸酸转化为10-HDA。本实验通过克隆筛选得到了两种可以形成10-HDA关键官能团的生物催化元件,并对其催化特性进行了研究。这对后续进一步利用合成生物学构建10-HDA合成途径具有重要的理论指导意义,为将来实现10-HDA的工业化生产探明方向。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第1章 绪论
  •   1.1 10-HDA概况
  •     1.1.1 10-HDA简介
  •     1.1.2 10-HDA功能
  •   1.2 10-HDA的生物合成
  •     1.2.1 常用的10-HDA合成方法
  •     1.2.2 10-HDA的生物合成相关研究
  •     1.2.3 细胞色素P450 酶系简介
  •     1.2.4 硫酯酶简介
  •   1.3 羟基脂肪酸的应用
  •   1.4 立题背景和研究内容
  •     1.4.1 立题背景
  •     1.4.2 研究内容
  • 第2章 细胞色素P450酶的筛选与异源表达
  •   2.1 引言
  •   2.2 实验材料与设备
  •     2.2.1 实验材料
  •     2.2.2 主要仪器
  •     2.2.3 培养基及主要试剂的配制
  •   2.3 实验方法
  •     2.3.1 穿刺菌的恢复培养
  •     2.3.2 细菌和真菌基因组DNA的提取
  •     2.3.3 质粒的提取
  •     2.3.4 引物设计
  •     2.3.5 细胞色素P450酶CYP102A1 基因的克隆
  • BM3基因的克隆'>    2.3.6 细胞色素P450酶P450BM3基因的克隆
  • BM3 CPR基因的克隆与融合'>    2.3.7 细胞色素P450酶CYP153A和 P450BM3CPR基因的克隆与融合
  •     2.3.8 细胞色素P450酶CYP52B1和CYP52B1 CPR基因的克隆与融合
  •     2.3.9 质粒pET-21b、pET-28a的双酶切
  •     2.3.10 目的基因与载体的连接
  •     2.3.11 大肠杆菌感受态BL21（DE3）的制备
  •     2.3.12 连接产物转化
  •     2.3.13 阳性重组菌株的筛选
  •     2.3.14 P450 酶的诱导表达及纯化
  •   2.4 结果与讨论
  •     2.4.1 基因组DNA的提取结果
  •     2.4.2 P450 酶基因的克隆
  •     2.4.3 pET-21b、pET-28a质粒的双酶切
  •     2.4.4 阳性菌株的筛选及鉴定
  •     2.4.5 镍柱亲和层析
  •   2.5 总结
  • 第3章 硫酯酶在大肠杆菌中的异源表达
  •   3.1 引言
  •   3.2 实验材料与设备
  •     3.2.1 实验材料
  •     3.2.2 主要试剂
  •     3.2.3 主要仪器
  •     3.2.4 培养基及主要试剂的配制
  •   3.3 实验方法
  •     3.3.1 大肠杆菌基因组DNA的提取
  •     3.3.2 pET-28a质粒的提取
  •     3.3.3 引物设计
  •     3.3.4 硫酯酶基因的克隆
  •     3.3.5 目的基因与表达载体的双酶切
  •     3.3.6 目的片段与与表达载体的连接
  •     3.3.7 连接产物的转化
  •     3.3.8 阳性重组菌株的筛选
  •   3.4 结果与讨论
  •     3.4.1 大肠杆菌杆菌基因组和质粒pET-28a的提取结果
  • 1和ydiI2的克隆'>    3.4.2 脂酰辅酶A硫酯酶基因ydiI1和ydiI2的克隆
  •     3.4.3 质粒的双酶切
  •     3.4.4 阳性菌株的筛选及鉴定
  •   3.5 总结
  • 第4章 工程菌的摇瓶发酵验证
  •   4.1 引言
  •   4.2 实验材料与设备
  •     4.2.1 实验材料
  •     4.2.2 主要仪器
  •     4.2.3 培养基及主要试剂的配制
  •   4.3 实验方法
  • BM3对脂肪酸的体内催化特性研究'>    4.3.1 细胞色素P450酶CYP102A1、P450BM3对脂肪酸的体内催化特性研究
  • BM3对脂肪酸的体外催化特性研究'>    4.3.2 细胞色素P450酶CYP102A1、P450BM3对脂肪酸的体外催化特性研究
  • BM3 CPR融合酶对癸酸的羟基化研究'>    4.3.3 细胞色素P450酶CYP153A-P450BM3CPR融合酶对癸酸的羟基化研究
  • BM3 CPR对不同浓度癸酸的羟基化研究'>    4.3.4 细胞色素P450酶CYP153A-P450BM3CPR对不同浓度癸酸的羟基化研究
  •     4.3.5 细胞色素P450酶CYP153A对癸酸钠的羟基化研究
  •     4.3.6 工程菌E.coil（pET-SUMO-ydiI）以癸烷为底物进行发酵
  •     4.3.7 工程菌E.coil（pET-SUMO-ydiI）以10-羟基癸酸为底物进行发酵
  •     4.3.8 工程菌E.coil（pET-SUMO-ydiI）以不同浓度10-羟基癸酸为底物进行发酵
  •     4.3.9 利用静息细胞检测不同时间产物的生成
  •   4.4 结果与讨论
  • BM3对脂肪酸的生物特性研究'>    4.4.1 细胞色素P450酶CYP102A1、P450BM3对脂肪酸的生物特性研究
  •     4.4.2 细胞色素P450酶CYP153A对癸酸的羟基化研究
  •     4.4.3 细胞色素P450酶CYP153A对癸酸钠的羟基化研究
  •     4.4.4 工程菌E.coil（pET-SUMO-ydiI）以癸烷为底物发酵结果
  •     4.4.5 工程菌E.coil（pET-SUMO-ydiI）以10-羟基癸酸为底物发酵结果
  •   4.5 总结
  • 第5章 结论与展望
  •   5.1 结论
  •   5.2 展望
  • 参考文献
  • 致谢
  • 在学期间主要科研成果

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 孙淑慧

    导师: 王瑞明,苏静

    关键词: 细胞色素酶,硫酯酶,氧化,静息细胞

    来源: 齐鲁工业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 齐鲁工业大学

    分类号: Q78

    总页数: 76

    文件大小: 3530K

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