交叉中和基因A型和基因C型鸭甲肝病毒单克隆抗体的制备与鉴定

论文摘要

鸭甲型肝炎（Duck hepatitis A,DHA）是危害养鸭业的主要疾病之一,可引起雏鸭的急性、高度致死性的传染病。根据其基因序列的差异,分为三个基因型（DHAV-A、DHAV-B和DHAV-C）,目前我国主要流行DHAV-A和DHAV-C,两种基因型病毒缺乏有效的交叉中和作用,严重影响本病的防控。研究表明,针对保守中和抗原表位的广谱中和抗体是应对这种情况的新策略。本研究拟针对DHAV-A和DHAV-C共同保护性抗原的保守序列研制单克隆抗体（Monoclonal antibody,McAb）,进而筛选出针对这两种基因型DHAV的广谱中和抗体,取得如下成果:1研制出与DHAV-A和DHAV-C具有交叉反应性的单克隆抗体根据DHAV-A和DHAV-C的VP1蛋白共有的氨基酸序列,利用生物信息学软件设计筛选出评分最高的12条长度为14肽的抗原表位,人工合成各肽段,分别与KLH载体蛋白偶联作为免疫抗原,免疫BALB/c小鼠制备McAb,获得了12株稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株。间接ELISA检测结果显示,其中6株McAb（C1、C4、C7、C12、C13、C16）同时与DHAV-A和DHAV-C发生交叉反应,而不与鸭瘟病毒（DPV）、新城疫病毒（NDV）和禽流感病毒（AIV）反应,为广谱中和McAb的筛选奠定了基础。2筛选出具有交叉中和活性的单克隆抗体2.1 McAb在鸭胚中的交叉中和活性为评价McAb的中和活性,将具有交叉反应性McAb分别与200ELD50DHAV-A和DHAV-C等体积混,接种12日龄SPF鸭胚绒毛尿囊腔,0.2mL/胚,进行中和试验,每个处理组5枚鸭胚,以鸭β-actin基因作为内参,采用Real-time PCR方法测定病毒荷载量,用2-△△CT法进行相对定量,评价6株具有交叉反应性的McAb对DHAV-A和DHAV-C的在鸭胚上的中和活性,并测定其中和效价。结果显示,6株McAb对DHAV-A和DHAV-C增殖的抑制率依次为:C1（84.4%&82.69%）、C4（90.79%&75.34%）、C7（86.23%&99.83%）、C12（14.74%&25.26%）、C13（38.87%&2.06%）和C16（99.61%&100%）。鸭胚中和试验结果中,6株McAb对DHAV-A、DHAV-C的中和效价分别为:C1（1:3&1:5）、C4（1:3&1:3）、C7（1:10&1:11）、C12（0&0）、C13（0&0）和C16（1:9&1:9）。据此筛选出4株（C1、C4、C7、C16）具有交叉中和活性的McAb。2.2 McAb对雏鸭的预防效果为了解4株对DHAV-A、DHAV-C具有交叉中和活性McAbs对雏鸭的交叉预防效果,1日龄雏鸭分组肌肉注射McAb,1mL/只,24 h后分别肌注DHAV-A、DHAV-C,100ELD50/只,每个处理组5只雏鸭。结果显示,4株McAb对DHAV-A、DHAV-C的保护率分别为:C1（30%&40%）、C4（40%&40%）、C7（70%&80%）、C16（100%&60%）。本研究结果显示,4株McAbs对两种不同基因型毒株均具有不同程度的交叉预防效果,其中C7、C16对DHAV-A和DHAV-C的攻击具良好的交叉预防作用,保护率达60%以上。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 鸭甲肝病毒及其单克隆抗体的研究进展
•   1 鸭甲肝病毒的分类及流行情况
•     1.1 鸭甲肝病毒的分类
•     1.2 鸭甲肝病毒的流行情况
•   2 鸭病毒性肝炎的临床症状及病理变化
•   3 鸭甲肝病毒单克隆抗体的研究进展
•     3.1 单克隆抗体的概念
•     3.2 McAb在 DHAV诊断中的应用
•     3.3 McAb用于DHAV感染机制的研究
•     3.4 McAb用于DHAV防治
•   4 本研究的目的及意义
• 第二章 鸭甲肝病毒单克隆抗体的制备
•   1 材料
•     1.1 病毒株及血清
•     1.2 实验动物与细胞株
•     1.3 主要试剂
•     1.4 仪器设备
•     1.5 试剂的配制
•   2 方法
•     2.1 抗原表位肽的设计
•     2.2 抗原表位肽的合成和偶联
•     2.3 免疫抗原制备及动物免疫
•     2.4 细胞融合
•     2.5 杂交瘤细胞的筛选
•     2.6 阳性杂交瘤细胞的冻存
•     2.7 杂交瘤细胞株的复苏与传代培养
•     2.8 小鼠腹水的制备
•     2.9 腹水抗体效价的测定
•     2.10 腹水中Mc Ab活性的鉴定
•     2.11 McAb体亚型鉴定
•     2.12 McAb特异性鉴定
•     2.13 McAb杂交瘤细胞的稳定性鉴定
•   3 结果
•     3.1 设计合成的抗原肽
•     3.2 杂交瘤细胞株的筛选结果
•     3.3 小鼠腹水中的抗体效价
•     3.4 McAb交叉反应性鉴定结果
•     3.5 McAb亚型鉴定结果
•     3.6 McAb的特异性
•     3.7 McAb杂交瘤细胞稳定性鉴定结果
•   4 讨论
•   5 小结
• 第三章 交叉中和DHAV-A和DHAV-C单克隆抗体的鉴定
•   1 材料
•     1.1 病毒株和细胞株
•     1.2 实验动物
•     1.3 主要试剂和仪器设备
•   2 方法
•     2.1 DHAV半数致死量（ELD50）的测定
•     2.2 McAb的制备
•     2.3 McAb对 DHAV-A和 DHAV-C在鸭胚中增殖的影响
•     2.4 McAb中和效价的测定
•     2.5 McAb对 DHAV感染雏鸭的预防效果测定
•   3 结果
•     3.1 DHAV半数致死量的计算
•     3.2 McAb对 DHAV在鸭胚中增殖的影响
•     3.3 McAb的中和效价
•     3.4 McAb预防效果
•   4 讨论
•   5 小结
• 全文结论与创新点
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘燕

导师: 岳华,周明忠

关键词: 鸭肝炎,基因型鸭甲肝病毒,单克隆抗体,广谱中和抗体

来源: 西南民族大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 西南民族大学

基金: “十三五”国家重点研发计划项目——鸭甲型肝炎病毒鸭源广谱中和抗体技术研究(2017YFD0501101)

分类号: S852.65

DOI: 10.27417/d.cnki.gxnmc.2019.000152

总页数: 48

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