基于二阶非线性光学的细胞膜研究技术的开发与应用

论文摘要

细胞膜界面涉及到诸多生理过程,比如分子穿膜、膜融合、催化反应、蛋白吸附等,是生命科学领域中一个很重要的研究方向。在过去的十几年,有多种实验技术用于细胞膜的研究,如分子动力学模拟、傅里叶变换红外光谱以及X-射线等。非线性光学技术也广泛应用于细胞膜研究,尤其二阶非线性光谱具有表界面选择性,对细胞膜表征具有优势。本文应用二阶非线性光学效应开发了一系列技术对物质与细胞膜相互作用过程以及模型细胞膜融合过程的研究。主要工作有应用二次谐波产生（second harmonic generation,SHG）光谱测量到了物质与细胞膜相互作用的动力学过程;应用二次谐波产生光谱和和频产生（sum frequency generation,SFG）光谱研究了金属离子诱导膜融合的机制;以及搭建了可以兼容SHG和双光子荧光（two-photon-excited fluorescence,TPEF）成像的双光子显微成像系统,具体工作内容分为以下几个部分:首先,研究了分子与细胞膜相互作用,应用基于SHG的二次谐波散射（second harmonic light scattering,SHS）技术研究了孔雀绿（malachite green,MG）分子与细菌、磷脂囊泡之间相互作用的动力学过程。应用SHS测量出Ca2+对MG分子穿膜的影响,并根据现象作出一定的推测;应用SHS测量出不同浓度的金属离子对穿膜过程的影响,Ca2+与Mg2+提高了MG分子穿膜速率,Cu2+则是会破坏细菌结构,使得SHS信号迅速下降为初始水平。在细菌以及模型细胞膜实验的基础上,也成功的应用SHS对穿膜肽与动物细胞的相互作用动力学过程进行了测量。其次,应用非线性光谱技术研究了金属离子诱导细胞膜融合机制。我们利用不同粒子大小的SHS信号出射方向不同,设计SHG光谱成功测量到了Ca2+诱导膜融合的过程。针对钙离子、镁离子与负电磷脂膜行为不同,应用SFG测量了磷脂分子与钙镁离子在反式络合、顺式络合等不同金属离子影响下磷脂分子的响应,对金属离子诱导细胞膜融合的机制进行了揭示。相对于钙离子,磷脂与Mg2+顺式结合,磷脂表面具有更强的水合层,磷脂端部有序度更高,这阻碍了细胞膜的进一步融合。最后,从硬件系统设计以及软件系统设计两个方面去论述双光子激发荧光显微成像系统的原理样机搭建过程。首先,设计并搭建双光子显微成像系统光路以及硬件控制系统。双光子显微成像系统的核心为激光扫描控制以及信号采集。本文采用双检流计型振镜控制激光扫描,设计以数据采集卡为控制核心的硬件控制方案,同时数据采集卡采集光电倍增管（photomultiplier tube,PMT）输出的信号用于图像重建;之后,设计双光子显微成像系统的软件系统。软件系统使用LabVIEW进行设计开发,配合数据采集卡可以高效地完成对硬件系统的控制。软件系统主要实现成像参数设置、振镜扫描方式控制、PMT增益级别设置、采集数据以及实时成像等功能。对于采集到的信号,在软件中嵌入MATLAB脚本代码对信号进行处理。应用双光子成像系统原理样机实现了小鼠耳朵部位胶原纤维的SHG成像,以及经DiO染色的里氏木霉膜的TPEF成像。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
•   1.1 引言
•   1.2 二阶非线性光学效应
•     1.2.1 二次谐波产生
•     1.2.2 和频产生光谱
•   1.3 双光子激发技术
•     1.3.1 双光子激发原理
•     1.3.2 双光子激发荧光显微镜
•   1.4 细胞穿膜肽
•     1.4.1 细胞穿膜肽的分类
•     1.4.2 细胞穿膜肽机制研究
•     1.4.3 细胞穿膜肽的研究和应用面临的挑战
•   1.5 细胞膜融合
•   1.6 本文的研究内容
• 第二章 分子与细胞膜相互作用的二阶非线性光谱测量
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 孔雀绿
•     2.1.2 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌
•     2.1.3 磷脂
•   2.2 样品制备与预处理
•     2.2.1 细菌与细胞培养
•     2.2.2 细胞处理与囊泡制备
•   2.3 SHS实验设备搭建
•   2.4 MG分子与细胞膜相互作用动力学过程的SHS研究
•     2.4.1 MG分子与两种细菌相互作用的动力学过程
•     2.4.2 钙离子对MG分子与大肠杆菌相互作用各个过程的影响
•     2.4.3 不同浓度的金属离子对MG分子穿膜速率的影响
•     2.4.4 MG分子与囊泡相互作用的动力学过程
•     2.4.5 穿膜肽与RPMI8226 骨髓瘤细胞相互作用动力学过程
•   2.5 本章小结
• 第三章 模型细胞膜融合的非线性光谱测量
•   3.1 实验方法
•     3.1.1 二次谐波散射光谱测量
•     3.1.2 和频光谱测量
•   3.2 实验结果与讨论
•     3.2.1 细胞膜融合动力学过程的SHS测量
•     3.2.2 和频光谱实验结果讨论
•   3.3 本章小结
• 第四章 双光子显微成像系统硬件系统设计
•   4.1 双光子显微成像系统搭建
•     4.1.1 双光子显微成像系统框架
•     4.1.2 双光子显微成像系统
•   4.2 激光器
•     4.2.1 激光器功能说明
•     4.2.2 激光器的控制
•   4.3 扫描振镜组控制
•     4.3.1 GV0122D扫描振镜系统
•     4.3.2 扫描振镜控制原理
•   4.4 数据采集系统
•     4.4.1 数据采集卡
•     4.4.2 光电倍增管工作原理
•     4.4.3 PMT增益调节原理
•     4.4.4 跨阻放大器工作原理
•     4.4.5 数据采集与扫描同步
•   4.5 本章小结
• 第五章 双光子显微成像系统软件系统设计
•   5.1 LabVIEW编程简介
•   5.2 系统软件设计框架
•   5.3 软件程序设计
•     5.3.1 界面设计
•     5.3.2 振镜控制程序设计
•     5.3.3 PMT控制程序设计
•     5.3.4 数据采集程序设计
•   5.4 成像结果分析
•     5.4.1 SHG成像结果分析
•     5.4.2 TPEF成像结果分析
•   5.5 本章小结
• 第六章 总结与展望
•   6.1 总结
•   6.2 展望
• 致谢
• 参考文献

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张男

导师: 韩晓锋

关键词: 二阶非线性光学,膜融合,二次谐波产生,和频光谱

来源: 东南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 物理学,生物学,生物医学工程

单位: 东南大学

分类号: R318;O437

DOI: 10.27014/d.cnki.gdnau.2019.003383

总页数: 86

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