木姜子FATB基因的克隆和功能分析

论文摘要

中短链脂肪酸（Medium-chain fatty acids,MCFAs）包括辛酸（8:0）、癸酸（10:0）、月桂酸（12:0）、肉豆蔻酸（14:0）,是工业生产洗涤剂、肥皂、化妆品、表面活性剂和润滑剂重要原料。目前中短链脂肪酸的生产不能满足我们日益增长的需求。通过基因工程手段把其他植物尤其是萼距花属植物中调控中短链脂肪酸的关键酶转化到作物中在国外已经取得了一定的成果,然而在我国这些研究还处于起步阶段。我国许多樟科植物种子中都含有中短链脂肪酸,具有丰富的遗传资源。在我国樟科植物木姜子种仁中,富含约50%的月桂酸和20%的癸酸,是发掘提高中短链脂肪酸关键酶很好的材料。在脂肪酸从头合成过程中,FATB酰基-ACP硫酯酶FATB是控制脂肪酸碳链长短的关键酶。通过同源克隆的方法,我们从木姜子种仁中克隆得到了FATB。通过构建木姜子的FATB基因表达载体,转化拟南芥植株中,在拟南芥转化株系中对上述克隆的基因进行功能分析。为进一步探讨木姜子种子中月桂酸积累的机理,我们对发育中后期种胚的转录组进行了分析。本研究获得如下主要结果:1)从木姜子中克隆得到了一个FATB基因,基因的全长为1257bp。通过与已知物种的脂肪酸酰基ACP硫酯酶进行比对发现,该基因编码的蛋白聚类到FATB类群而不是FATA,并且我们的FATB蛋白的166Q、196W、198V、225G、226K、227N、228G位点,共同组成了硫酯酶活性部位4HBT。因此,将该基因命名为LpFATB。2)通过酶切连接的手段,将所得到的FATB基因构建到35S启动子启动的植物表达载体上。转化野生型拟南芥Col-0,通过对T3代转化株系种子进行气相色谱分析,发现以Col-0为背景的LpFATB转化株系种子中,棕榈酸（16:0）的含量有明显提升,油酸（18:1）、二十碳烯酸（20:1）的含量都有一定程度的降低。棕榈酸较未转化的拟南芥野生型Col-0提高了2-3倍,最高达到了25.3%。这个结果表明,木姜子的LpFATB基因在拟南芥脂肪酸从头合成途径中对16:0-ACP的底物偏好性更强,而不是12:0-ACP。3)为了探究我们得到的FATB是否是木姜子种仁中唯一的一个,我们利用Illumina测序平台对木姜子发育中后期的种胚组织进行转录组测序,最终得到38897条高质量Unigenes序列。在获得的木姜子转录组数据中,通过将Unigenes与已知模式植物拟南芥基因序列进行比对分析,我们共发现247个Unigenes编码参与脂类代谢途径（包括脂肪酸合成、三酰甘油装配以及和油脂代谢相关的酶以及转录因子）。然而,我们并没有发现木姜子中存在与我们先前克隆的FATB不一样的拷贝。4)通过分析木姜子FATB与已经验证功能的可以在拟南芥中提高12:0的加州月桂FATB蛋白序列之间的差异,发现两个序列之间的N末端差异较大,可能是造成功能差异的原因,因此我们利用结构互换的方法把木姜子N端序列替换成加州月桂的N端序列,然而结果还是和木姜子FATB转化结果类似。这一结果表明,木姜子与加州月桂FATB之间在N端序列的差异,可能并不是造成底物差异的关键部位。并且,不同N端序列可能影响FATB的活性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1.文献综述
•   1.1 中短链脂肪酸用途
•   1.2 植物特殊脂肪酸与木姜子
•   1.3 植物脂肪酸合成与和装配
•     1.3.1 植物脂肪酸合成
•     1.3.2 植物脂肪酸的装配
•   1.4 酰基-ACP硫酯酶基因的研究进展
•     1.4.1 酰基-ACP硫酯酶基因的分类和功能研究
•     1.4.2 酰基-ACP硫酯酶蛋白结构的研究
•     1.4.3 FATB研究进展
•   1.5 植物脂肪酸基因工程的研究进展
•   1.6 本研究的目的以及意义
• 2.材料与方法
•   2.1 实验所需材料
•   2.2 拟南芥种子脂肪酸组分分析
•   2.3 木姜子种子脂肪酸成分分析
•   2.4 总RNA提取与c DNA单链合成
•   2.5 异源表达FATB植物表达载体的构建及拟南芥转基因植株的获得
•     2.5.1 同源克隆引物设计与基因的克隆
•     2.5.2 表达载体的改造
•     2.5.3 构建LpFATB表达载体
•   2.6 拟南芥转基因植株的获得
•   2.7 RNA-Seq转录组数据分析
• 3.结果与分析
•   3.1 木姜子种仁不同发育阶段的脂肪酸分析
•   3.2 木姜子LpFATB基因的全长克隆及相应的生物信息学分析
•     3.2.1 木姜子LpFATB基因的全长克隆
•     3.2.2 木姜子LpFATB的初步生物信息学分析
•   3.3 木姜子LpFATB基因转化拟南芥T3代株系脂肪酸组分的分析
•   3.4 木姜子种仁转录组分析
•   3.5 改造FATB N端没能在拟南芥中得到月桂酸
• 4.讨论
•   4.1 木姜子LpFATB基因的功能分析
•   4.2 木姜子FATB不能产生中短链脂肪酸的原因分析
•   4.3 木姜子LpFATB基因的氨基酸位点与功能分析
• 5.结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王凯

导师: 张猛

关键词: 木姜子,中短链脂肪酸,酰基硫酯酶,拟南芥

来源: 西北农林科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 西北农林科技大学

基金: 国家自然科学基金(编号:31270295)

分类号: Q943.2

总页数: 54

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