马槟榔甜蛋白基因（MabinlinⅡ）的密码子优化及其在大肠杆菌中的表达

论文摘要

植物甜蛋白是从植物种分离提取到的植物蛋白,由于甜蛋白甜度高、热量低、比合成甜味剂安全,不会导致肥胖、安全无毒等优点[1],使得甜蛋白作为新型甜味剂,广受青睐。本研究主要目的是探索MabinlinⅡ甜蛋白在原核生物中的表达以及检测表达的蛋白的甜味。野生马槟榔植株主要分布在云南和广西等热带和亚热带地区,由于地理气候等自然原因,马槟榔植株数量稀少,濒危灭绝。本研究预期借助大肠杆菌表达载体,表达优化过的MabinlinⅡ甜蛋白基因,探究甜蛋白是否能大量表达。为MabinlinⅡ甜蛋白的开发提供一些理论基础。目前MabinlinⅡ甜蛋白基因已经能够在大肠杆菌中表达,为了进一步提高表达量以及测定其甜味活性,在NCBI查询得到MabinlinⅡ甜蛋白基因全长序列,依据大肠杆菌对密码子的利用率不同,将稀有密码子置换为常用密码子,对468 bp长度的转座酶密码子进行了优化。本研究目的则是使用pET28a（+）作为克隆表达载体,E.coli BL21（DE3）作为表达菌,表达出密码子优化后的468 bp长度MabinlinⅡPlus甜蛋白基因和去掉序列中编码氨基酸的信号肽、N-端肽,C-端肽的321 bp长度的MabinlinⅡ（AB）Plus,比较这两段序列那种能更好的表达蛋白,并研究如何能提高蛋白表达量,为了获得更高效的表达,本研究还进行了表达条件优化,并用Western Blot对所表达的蛋白进行鉴定,用Ni-NTA琼脂糖树脂介质对得到的蛋白进行纯化,最后通过感官评定实验和电子舌测定对目的蛋白进行甜味测定。本实验主要分为四个部分。第一部分为重组表达载体的构建,首先依据大肠杆菌对密码子的简并性和偏好性对MabinlinⅡ甜蛋白基因编码区序列（GI:1817545）的密码子进行优化,优化后的MabinlinⅡ甜味蛋白基因命名为MabinlinⅡPlus,去掉MabinlinⅡPlus序列中的信号肽、N-端肽,C-端肽,剪切后的基因命名为MabinlinⅡ（AB）Plus。用BamHI和XhoI分别对含有基因序列MabinlinⅡPlus和MabinlinⅡ（AB）Plus的克隆载体以及表达载体pET28a（+）的限定位点分别剪切,用T4 DNA连接酶将表达载体pET28a（+）分别与基因序列MabinlinⅡPlus和MabinlinⅡ（AB）Plus连接。根据用基因MabinlinⅡPlus和MabinlinⅡ（AB）Plus分别设计合适的PCR扩增引物对,将重组质粒pET28a（+）-MabinlinII Plus和pET28a（+）-MabinlinII（AB）Plus分别转化到DH5α感受态,平板划线过夜培养后用菌落PCR,取0.2 mL电泳结果阳性的质粒的菌液送往测序公司。测序成功的序列与原序列用BioEdit比较核苷酸序列。序列对比结果表明,重组表达载体pET28a（+）-MabinlinII Plus和pET28a（+）-MabinlinII（AB）Plus构建成功。第二部分为重组载体pET28a（+）-MabinlinII Plus和pET28a（+）-MabinlinII（AB）Plus的原核表达、表达条件的优化。本实验中选择BL21（DE3）作为表达的宿主菌,使得两个重组载体质粒在BL21（DE3）中表达,用SDS-PAGE（SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳）分析。实验结果表明,重组载体pET28a（+）-MabinlinII Plus在蛋白分子量大约为26.0 kDa处有相对应的条带出现,经过对诱导剂IPTG浓度、诱导温度、诱导时间,诱导的起始生长量OD600等表达条件的优化,始终未见表达量有所提高;而重组载体pET28a（+）-MabinlinII（AB）Plus有明显的有明显的诱导表达条带,而且经过表达条件优化后蛋白条带有明显加深,即目的蛋白得到大量表达。将基因未经优化的重组载体BL21（DE3）/pET28a（+）-MabinlinII（AB）与优化后的重组载体BL21（DE3）/pET28a（+）-MabinlinII（AB）Plus在最优条件下进行诱导表达,取总蛋白SDS-PAGE分析,经Band-Scan凝胶成像系统分析,显示基因优化后的重组载体BL21（DE3）/pET28a（+）-MabinlinII（AB）Plus的表达量为33%,优化前的表达量为26%,基因优化后的重组载体的表达量比基因优化前提高了7%。第三部分为克隆载体pET28a（+）-MabinlinII（AB）Plus在BL21（DE3）产生的目的蛋白的纯化和鉴定。将大肠杆菌产生的菌体总蛋白用SDS-PAGE电泳分析,可观察到在19 kDa有符合预期的蛋白带,故我们采用Ni-NTA琼脂糖树脂介质,将反复冻融、超声破碎、离心取得的上清进行蛋白纯化,将最终收集的纯化样品用SDS-PAGE分析,并用Western Blot对所表达的蛋白进行鉴定。结果表明,目的重组蛋白即为基因优化后的MabinlinⅡ甜蛋白。第四部分为MabinlinⅡ甜蛋白的甜味检测。选择两种甜味检测方法,第一种是感官检测,采用“A”-非“A”试验,评定人员品尝后能准确找出样品并说出样品味觉特点,与蔗糖标准溶液对比,样品有强烈的后甜感,可以明显将样品与对照区分开;“双盲”感官检验对样品进行评测结果显示甜蛋白的甜度约为2%标准蔗糖溶液的400倍。第二种是利用仿生电子舌对样品进行定性和定量分析。用蔗糖、氯化钠、硫酸镁、柠檬酸、谷氨酸钠对照,比较样品的风味;测定不同浓度梯度的蔗糖溶液,做标准曲线,定量分析结果显100 mL大肠杆菌生产的MabinlinⅡ甜蛋白的甜度等同于0.4 g纯度为99.7%的蔗糖的甜度。

论文目录

• 摘要
• Abtract
• 引言
•   1 甜蛋白的种类
•   2 甜蛋白的研究进展
•   3 甜蛋白MabinlinⅡ的特性和应用
•   4 研究目的和意义
• 第一章 MabinlinⅡ的密码子优化及原核表达载体的构建
•   1 材料
•     1.1 MabinlinⅡ Plus与 MabinlinⅡ（AB）Plus的优化合成
•     1.2 质粒和菌株
•     1.3 主要实验仪器、设备
•     1.4 主要实验试剂、试剂盒
•     1.5 试剂的配制
•   2 方法
•     2.1 重组表达载体pET28a（+）-MabinlinⅡ Plus的构建
•       2.1.1 质粒pUC57-simple-MabinlinⅡ Plus的提取
•       2.1.2 获取MabinlinⅡ Plus
•     2.1.2.1 MabinlinⅡ Plus的克隆
•     2.1.2.2 检测电泳
•     2.1.2.3 回收电泳
•     2.1.2.4 割胶回收
•       2.1.3 载体pET28a（+）的酶切
•       2.1.4 连接和转化
•     2.1.4.1 片段MabinlinⅡ Plus与 pET28a（+）连接
•     2.1.4.2 克隆载体pET28a（+）-MabinlinⅡ Plus转化到DH5α
•       2.1.5 DH5α/pET28a（+）-MabinlinⅡ Plus菌液的PCR鉴定
•       2.1.6 重组质粒pET28a（+）-MabinlinⅡ Plus测序
•     2.2 重组表达载体pET28a（+）-MabinlinⅡ（AB）Plus的构建
•       2.2.1 获取MabinlinⅡ（AB）Plus
•       2.2.2 载体pET28a（+）的酶切
•       2.2.3 连接和转化
•     2.2.3.1 片段MabinlinⅡ（AB）Plus与 pET28a（+）连接
•     2.2.3.2 pET28a（+）-MabinlinⅡ（AB）Plus转化至DH5α
•       2.2.4 DH5α/pET28a（+）-MabinlinⅡ（AB）Plus菌液的PCR鉴定
•       2.2.5 重组质粒pET28a（+）-MabinlinⅡ（AB）Plus测序
•     2.3 实验结果
•       2.3.1 MabinlinⅡ Plus与 MabinlinⅡ（AB）Plus的优化、合成
•       2.3.2 目的片段MabinlinⅡ Plus的获得
•       2.3.3 载体片段的获得
•       2.3.4 目的片段MabinlinⅡ（AB）Plus的获得
•       2.3.5 重组载体DH5α/pET28a（+）-MabinlinⅡ Plus的构建
•       2.3.6 重组载体DH5α/pET28a（+）-MabinlinⅡ（AB）Plus的构建
•     2.4 小结
• 第二章 重组载体在BL21（DE3）中的诱导表达
•   1 材料
•     1.1 菌株
•     1.2 实验仪器
•     1.3 实验试剂
•     1.4 主要试剂配制
•   2 方法
•     2.1 BL21（DE3）/pET28a（+）-MabinlinⅡ Plus工程菌的构建
•     2.2 pET28a（+）-MabinlinⅡ Plus的诱导表达
•       2.2.1 pET28a（+）-MabinlinⅡ Plus的表达条件初探
•       2.2.2 重组蛋白的SDS-PAGE分析
•       2.2.3 pET28a（+）-MabinlinⅡ Plus表达条件优化
•     2.3 BL21（DE3）/pET28a（+）-MabinlinⅡ（AB）Plus的构建
•     2.4 pET28a（+）-MabinlinⅡ（AB）Plus的诱导表达
•       2.4.1 pET28a（+）-MabinlinⅡ（AB）Plus的表达条件初探
•       2.4.2 pET28a（+）-MabinlinⅡ（AB）Plus表达条件优化
•     2.4.2.1 诱导剂浓度的探索
•     2.4.2.2 诱导剂温度的探索
•     2.4.2.3 起始生长量的探索
•     2.4.2.4 诱导时间的探索
•     2.5 探究密码子优化前后的目的蛋白表达量
•   3 结果
•     3.1 pET28a（+）-MabinlinⅡ Plus的初步诱导
•     3.2 pET28a（+）-MabinlinⅡ Plus的表达条件优化
•     3.3 pET28a（+）-MabinlinⅡ（AB）Plus的初步诱导
•     3.4 pET28a（+）-MabinlinⅡ（AB）Plus的表达条件优化
•       3.4.1 最适IPTG浓度的确定
•       3.4.2 最佳诱导剂温度的确定
•       3.4.3 最适起始生长量的确定
•       3.4.4 最佳诱导时间的确定
•     3.5 密码子优化的前后目的蛋白表达量比较
•   4 小结
• 第三章 MabinlinⅡ甜蛋白的纯化及鉴定
•   1 材料
•     1.1 实验材料
•     1.2 实验仪器
•     1.3 实验试剂
•     1.4 主要实验试剂的配制
•   2 方法
•     2.1 Mabinlin Ⅱ甜蛋白的纯化
•       2.1.1 细菌的培养
•       2.1.2 纯化样品的制备
•       2.1.3 Mabinlin Ⅱ甜蛋白的的Ni-NTA亲和纯化
•       2.1.4 纯化得到的Mabinlin Ⅱ甜蛋白SDS-PAGE分析
•     2.2 Mabinlin Ⅱ甜蛋白的Western Blot分析
•       2.2.1 转膜
•       2.2.2 免疫反应
•       2.2.3 辣根过氧化物酶（DAB）法检测
•   3 结果
•   4 小结与讨论
• 第四章MabinlinⅡ蛋白的甜味检测
•   1 材料
•     1.1 样品
•     1.2 主要试剂
•     1.3 主要实验仪器
•     1.4 试剂的配制
•   2 方法
•     2.1 样品处理
•     2.2 “A”-非“A”试验
•     2.3 “双盲”感官检验
•     2.4 电子舌测定分析
•       2.4.1 甜蛋白定性分析方法
•       2.4.2 甜蛋白定量分析方法
•   3 结果
•     3.1 感官评定结果
•     3.2 电子舌测定结果
•       3.2.1 甜蛋白样品的定性分析
•       3.2.2 甜蛋白样品的定量分析
•   4 小结与讨论
• 结论与展望
•   1 结论
•   2 展望
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 何明娟

导师: 潘迎捷,蒋霞云,刘宁

关键词: 马槟榔,甜蛋白,密码子优化,原核表达,纯化,电子舌

来源: 上海海洋大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 上海海洋大学

分类号: Q943.2

DOI: 10.27314/d.cnki.gsscu.2019.000525

总页数: 72

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