致脑膜炎大肠杆菌诱导EGR-1介导血脑屏障通透性破坏的分子机制研究

论文摘要

细菌性脑膜炎对于人类健康和畜禽养殖都是一个巨大的挑战。在人医方面细菌性脑膜炎为十大引发高死亡率的感染性疾病之一,并且大部分的幸存者会留下不同程度的神经系统后遗症;在兽医方面大量养殖动物由于患脑膜炎失去了其经济价值,给畜牧产业造成了巨大的经济损失。肠外致病性大肠杆菌（Extraintestinal pathogenic Escherichia coli,ExPEC）近年来受到了广泛的关注,它可以感染宿主多个器官,导致尿路感染以及脑膜炎等。同时,ExPEC还能感染宠物导致疾病的交互传播,污染食物造成食品卫生安全恐慌。因此,ExPEC引起不同宿主的相关疫病已经成为严重影响人类健康、食品安全和畜牧养殖业发展的一类重要人畜共患传染病。目前为止,关于ExPEC脑膜炎的研究主要集中于E.coli侵入中枢神经系统（Central nervous system,CNS）过程中侵入相关宿主靶基因的筛选。而对于,参与致脑膜炎E.coli破坏血脑屏障（Blood-brain barrier,BBB）通透性过程的宿主基因的功能报道较少。本研究以临床分离的不同种属来源的ExPEC为基础,结合致脑膜炎E.coli感染人脑微血管内皮细胞（Human brain microvascular endothelial cells,hBMECs）差异mRNAs和非编码RNAs测序结果,探索致脑膜炎E.coli诱导中枢炎症过程中介导BBB通透性增加的分子机制。在本研究中,将本实验室保存的7株人源、20株猪源和3株禽源ExPEC菌株分别进行了细菌侵入hBMECs细胞以及小鼠脑组织定植实验。共鉴定发现了PCN033、Xiantao10、ACN005、PCN079、HCN10618、PCN080、A764以及B958等8株侵入hBMECs细胞能力较强的菌株,其中PCN033和A764这两株菌株在小鼠血液中的存活能力以及脑组织中的定植能力较强。由于PCN033分离自发病猪的脑脊液,所以选择PCN033作为后续实验菌株。同时,我们发现致脑膜炎E.coli通过下调紧密连接蛋白（Tight junctions,TJs）在hBMECs细胞上的表达以及改变其在细胞上的分布情况增加BBB的通透性。随后,利用全转录组测序技术对致脑膜炎E.coli感染hBMECs细胞胞内差异表达的mRNAs和非编码RNAs进行了分析,共鉴定到366个mRNAs、895个lncRNAs（Long non-coding RNAs）、32个miRNAs（Micro RNAs）以及308个circRNAs（Circular RNAs）发生了差异显著的变化,并绘制了差异变化的circRNAs、miRNAs以及mRNAs的调控网络关系图。通过分析致脑膜炎E.coli感染hBMECs细胞全转录组数据,我们挖掘了致脑膜炎E.coli感染宿主破坏BBB完整性过程中的核心宿主因子EGR-1的生物学功能。通过hBMECs EGR-1基因缺失细胞系和EGR-1基因缺失小鼠,分别从体内和体外证明了EGR-1对于中枢炎症以及BBB通透性的调控作用。我们发现转录调节因子EGR-1在感染早期显著上调表达,可以入核直接调控VEGFA、PDGFB、ICAM-1以及TNFα的表达。通过更进一步的体内、体外实验,我们发现致脑膜炎E.coli感染宿主上调EGR-1的表达诱导VEGFA和PDGF-BB大量分泌,血液循环中过量存在的VEGFA和PDGF-BB作用于BMECs细胞导致TJs表达量下降且分布发生改变。在另一方面,致脑膜炎E.coli感染宿主诱导转录调节因子Snail-1显著上调,Snail-1可以直接入核负调控ZO-1和Occludin等TJs的表达,同样起到促进BBB通透性增加的作用。同时,致脑膜炎E.coli感染宿主上调EGR-1的表达诱导BMECs细胞活化指示蛋白ICAM-1显著上调,在感染初期ICAM-1在BMECs细胞上的大量表达直接促进免疫细胞穿越BBB进入脑实质介导CNS炎症反应,进而造成BBB通透性增加。此外,本研究首次在细菌性脑膜炎模型中,对circRNAs的功能进行了研究,发现致脑膜炎E.coli感染hBMECs细胞之后hsacirc2858的表达显著上调,并且可以通过海绵作用吸附hsa-miR-93-5p介导VEGFA的上调表达。本研究阐明了EGR-1在致脑膜炎E.coli感染宿主导致BBB通透性增加以及神经炎症过程中的功能,为今后细菌性脑膜炎的预防和治疗提供了新的思路和潜在靶点。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表（Abbreviation）
• 第1章 文献综述
•   1.1 细菌性脑膜炎概述
•     1.1.1 细菌性脑膜炎流行动态
•     1.1.2 细菌性脑膜炎的发病机制和病理生理学特征
•   1.2 中枢神经系统的屏障
•     1.2.1 血脑屏障的组成
•     1.2.2 血脑脊液屏障
•     1.2.3 血脑屏障通透性的调控分子
•   1.3 致病性E.coli黏附侵入宿主细胞的分子机制
•     1.3.1 肠内致病性E.coli研究进展
•     1.3.2 致肾盂肾炎E.coli研究进展
•     1.3.3 致脑膜炎E.coli研究进展
•   1.4 非编码RNA功能概述
•     1.4.1 长链非编码RNA与病原感染
•     1.4.2 环状RNA分子功能介绍
•   1.5 立题依据
• 第2章 致脑膜炎E.coli菌株的筛选与致病性研究
•   2.1 前言
•   2.2 实验材料
•     2.2.1 菌株及细胞
•     2.2.2 主要试剂及试剂盒
•     2.2.3 培养基及主要溶液的配制
•     2.2.4 主要实验器材
•     2.2.5 实验动物
•     2.2.6 引物
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 E.coli菌株的复苏和传代培养
•     2.3.2 细胞的复苏和传代培养
•     2.3.3 细菌的侵入实验
•     2.3.4 致脑膜炎E.coli感染h BMECs细胞实验
•     2.3.5 小鼠感染实验
•     2.3.6 BBB通透性实验
•     2.3.7 脑组织取材、固定和脑切片制作
•     2.3.8 HE染色、免疫组化以及免疫荧光
•     2.3.9 细胞以及组织样品RNA、蛋白的提取
•     2.3.10 cDNA模板制备
•     2.3.11 SYBR Green法荧光定量PCR
•     2.3.12 蛋白质免疫印迹
•     2.3.13 细胞因子和趋化因子检测
•     2.3.14 统计学分析
•   2.4 结果与分析
•     2.4.1 体内和体外BBB模型筛选致脑膜炎E.coli菌株
•     2.4.2 致脑膜炎E.coli感染对BBB通透性的影响
•   2.5 讨论
•     2.5.1 不同种属来源E.coli穿越BBB能力的强弱
•     2.5.2 致脑膜炎E.coli破坏BBB通透性的分子机制
•   2.6 小结与展望
• 第3章 致脑膜炎E.coli感染hBMECs细胞的全转录组学研究
•   3.1 前言
•   3.2 实验材料
•     3.2.1 菌株及细胞
•     3.2.2 主要试剂及试剂盒
•     3.2.3 培养基及主要溶液的配制
•     3.2.4 主要实验器材
•     3.2.5 引物
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 菌株以及细胞培养
•     3.3.2 全转录组测序样品的制备
•     3.3.3 LncRNA以及mRNA文库的构建、测序以及原始数据过滤
•     3.3.4 LncRNAs以及mRNAs差异表达分析
•     3.3.5 差异mRNAs KEGG富集分析
•     3.3.6 miRNA文库的构建、测序以及原始数据过滤
•     3.3.7 miRNAs差异表达分析
•     3.3.8 CircRNA文库的构建、测序以及原始数据过滤
•     3.3.9 CircRNAs差异表达分析
•     3.3.10 竞争性内源RNA分析
•     3.3.11 细胞因子刺激hBMECs细胞实验
•     3.3.12 RNA的提取以及荧光定量PCR
•     3.3.13 质粒的小量提取
•     3.3.14 去内毒素质粒大提
•     3.3.15 质粒的转染
•     3.3.16 双荧光素酶实验
•     3.3.17 统计学分析
•   3.4 结果与分析
•     3.4.1 致脑膜炎E.coli感染hBMECs细胞差异lncRNAs、mRNAs分析
•     3.4.2 差异mRNAs KEGG信号通路富集分析
•     3.4.3 炎性因子对hBMECs细胞中lncRNAs表达的影响
•     3.4.4 差异表达lncRNAs的细胞特异性分析
•     3.4.5 致脑膜炎E.coli感染hBMECs细胞差异miRNAs分析
•     3.4.6 致脑膜炎E.coli感染hBMECs细胞差异circRNAs分析
•     3.4.7 hBMECs细胞表达circRNAs的特征分析
•     3.4.8 CircRNAs-miRNAs-mRNAs调控网络的绘制及验证
•   3.5 讨论
•     3.5.1 炎性因子与差异表达lncRNAs的关系
•     3.5.2 LncRNAs表达的细胞特异性
•     3.5.3 E.coli感染导致宿主miRNA表达谱改变
•     3.5.4 差异circRNAs作为E.coli脑膜炎诊断的指示分子
•     3.5.5 CircRNAs作为ceRNAs调控E.coli脑膜炎
•   3.6 小结与展望
• 第4章 EGR-1 调控中枢炎症和BBB通透性的分子机制研究
•   4.1 前言
•   4.2 实验材料
•     4.2.1 菌株及细胞
•     4.2.2 主要试剂及试剂盒
•     4.2.3 培养基及主要溶液的配制
•     4.2.4 主要实验器材
•     4.2.5 实验动物
•     4.2.6 引物
•   4.3 实验方法
•     4.3.1 菌株以及细胞培养
•     4.3.2 ELISA实验
•     4.3.3 hBMECs细胞基因干扰实验
•     4.3.4 ECIS细胞动态分析实验
•     4.3.5 CRISPR-Cas9 技术在hBMECs细胞中构建基因缺失细胞系
•     4.3.6 细胞间黏附实验
•     4.3.7 染色质免疫共沉淀实验
•     4.3.8 分离小鼠脑血管内皮细胞
•     4.3.9 组织基因组DNA的提取
•     4.3.10 统计学分析
•   4.4 结果与分析
•     4.4.1 致脑膜炎E.coli感染宿主EGR-1 的表达情况
•     4.4.2 hBMECs细胞EGR-1 基因缺失细胞系的构建
•     4.4.3 EGR-1 对于CNS炎症的影响
•     4.4.4 EGR-1 对于BBB通透性的影响
•     4.4.5 致脑膜炎E.coli感染宿主VEGFA的表达情况
•     4.4.6 VEGFA对 BBB通透性的影响
•     4.4.7 致脑膜炎E.coli感染宿主Snail-1 的表达情况
•     4.4.8 Snail-1对BBB通透性的影响
•     4.4.9 致脑膜炎E.coli感染宿主PDGF-BB的表达情况
•     4.4.10 PDGF-BB对 BBB通透性的影响
•     4.4.11 致脑膜炎E.coli感染宿主ICAM-1 的表达情况
•     4.4.12 ICAM-1 对于CNS炎症的影响
•     4.4.13 EGR-1 对于BBB通透性和炎症相关分子的调控作用
•   4.5 讨论
•     4.5.1 VEGFA对于BBB通透性的调控作用
•     4.5.2 Snail-1 调控TJs表达的分子机制
•     4.5.3 PDGF-BB对于BBB通透性的调控作用
•     4.5.4 ICAM-1 介导中枢炎症反应的分子机制
•     4.5.5 EGR-1 对于炎症反应的调控作用
•     4.5.6 EGR-1 对于BBB通透性的调控作用
•   4.6 小结与展望
• circ₂858 调控VEGFA的分子机制研究'>第5章 Hsa_circ₂858 调控VEGFA的分子机制研究
•   5.1 前言
•   5.2 实验材料
•     5.2.1 菌株及细胞
•     5.2.2 主要试剂及试剂盒
•     5.2.3 培养基及主要溶液的配制
•     5.2.4 主要实验器材
•     5.2.5 引物
•   5.3 实验方法
•     5.3.1 菌株以及细胞培养
•     5.3.2 RNA荧光原位杂交实验
•     5.3.3 统计学分析
•   5.4 结果与分析
•     5.4.1 Hsa-miR-93-5p对于VEGFA的调控作用
• circ₂858 的预测以及鉴定'>    5.4.2 Hsa_circ₂858 的预测以及鉴定
• circ₂858与hsa-miR-93-5p之间的相互作用'>    5.4.3 Hsa_circ₂858与hsa-miR-93-5p之间的相互作用
• circ₂858对VEGFA的调控作用'>    5.4.4 Hsa_circ₂858对VEGFA的调控作用
•   5.5 讨论
•     5.5.1 非编码RNA对于VEGFA的调控作用
•     5.5.2 CircRNAs调控BBB通透性的分子机制
•   5.6 小结与展望
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 个人简历
• 发表文章
• 致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 杨瑞成

导师: 陈焕春

关键词: 致脑膜炎大肠杆菌,人脑微血管内皮细胞,全转录组分析,血脑屏障通透性,早期生长反应因子

来源: 华中农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 华中农业大学

分类号: S852.61

DOI: 10.27158/d.cnki.ghznu.2019.000063

总页数: 196

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