转录因子HpoR对牛分枝杆菌PDIM合成基因簇表达及病原-宿主相互作用的调控

论文摘要

结核分枝杆菌具有独特的细胞壁结构,与病原菌致病性息息相关。其中,最具代表性的成分是结核菌醇蜡分支酸酯（PDIM）,它位于细菌细胞壁的表面,对维持细胞壁的完整性十分重要。同时,PDIM也是结核分枝杆菌重要的毒力因子之一,它的生物合成和转运对细菌感染宿主以及感染后在宿主胞内的存活发挥了不可或缺的重要作用。但是,目前我们对于PDIM代谢基因的表达调控了解得非常少,直接相关的转录调控因子尚未鉴定。本研究利用M.bovis BCG为模式菌株,首次发现和鉴定了转录因子HpoR可以直接调控PDIM合成基因簇的表达,具体结果如下:（1）利用凝胶阻滞实验（EMSA）以及染色质免疫沉淀实验（ChIP）证明了HpoR在M.bovis BCG细菌体内以及体外均能与PDIM操纵子的启动子bcg2950p结合,而且这种结合具有明显的序列特异性;（2）通过设计、制备涵盖不同长度的bcg2950p DNA片段,EMSA实验发现HpoR特异性结合在bcg2950p的P1区段,进一步测序分析发现其中含有一个保守的反向回文结构;（3）β-半乳糖苷酶活性实验及实时荧光定量PCR（qRT-PCR）证明了HpoR是一个转录抑制子,阻遏靶基因的表达;超表达HpoR时PDIM基因簇的表达下调,HpoR敲除则导致PDIM基因簇表达上调;（4）利用不同HpoR重组菌株感染巨噬细胞后发现,敲除HpoR会增强BCG菌株在巨噬细胞内的存活,相反HpoR超表达则导致细菌在巨噬细胞内存活率下降;（5）通过比较不同重组菌株感染巨噬细胞后细胞因子分泌水平,发现HpoR敲除菌株导致促炎细胞因子IL-6分泌明显上升;（6）检测感染后细胞表型,发现HpoR超表达BCG菌株感染的巨噬细胞凋亡率上升,ROS水平也相应上升。因此,本论文成功鉴定了一个直接参与调控PDIM基因簇表达的新转录因子HpoR,并初步发现了其在分枝杆菌感染宿主细胞过程中的重要作用,这些工作为后续进一步研究结核分枝杆菌的基因调控与致病机理提供了重要线索。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 前言
•   1.1 分枝杆菌与分枝杆菌细胞壁
•     1.1.1 分枝杆菌与结核病
•     1.1.2 分枝杆菌细胞壁
•   1.2 分枝杆菌的转录调控
•     1.2.1 转录因子家族概述
•     1.2.2 TetR家族转录因子
•     1.2.3 分枝杆菌的脂质调控
•     1.2.4 转录因子HpoR
•   1.3 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
•   2.1 实验材料与试剂
•     2.1.1 供试菌株与细胞
•     2.1.2 供试质粒
•     2.1.3 培养基
•     2.1.4 实验所用引物
•     2.1.5 抗生素和酶
•     2.1.6 细胞实验相关试剂
•     2.1.7 其他主要试剂配方
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 基因克隆
•     2.2.2 蛋白质表达纯化、透析及检测
•     2.2.3 细菌总蛋白的提取与纯化
•     2.2.4 转录因子的DNA结合活性分析
•     2.2.5 靶基因鉴定和分析
•     2.2.6 细胞表型的研究
• 3 结果与分析
•   3.1 HpoR靶基因的鉴定
•     3.1.1 转录组学分析发现HpoR参与调控脂代谢相关基因的表达
•     3.1.2 定量蛋白质组学证实HpoR调控PDIM代谢相关酶的表达
•     3.1.3 组学联合分析发现HpoR调控PDIM基因簇
•   3.2 HpoR基因克隆和蛋白质纯化
• 2950p调控PDIM操纵子表达'>  3.3 HpoR特异性结合bcg₂950p调控PDIM操纵子表达
• 2950p'>    3.3.1 凝胶阻滞实验（EMSA）证明HpoR特异性结合启动子bcg₂950p
• 2950p'>    3.3.2 染色质免疫沉淀实验证明HpoR在体内能结合bcg₂950p
•   3.4 HpoR作为阻遏子负调控靶基因的表达
•     3.4.1 β-半乳糖苷酶活实验证实Hpo R是一个抑制子
•     3.4.2 q RT-PCR实验证实Hpo R负调控下游靶基因的表达
•   3.5 HpoR抑制细菌的胞内生存能力
•   3.6 HpoR抑制炎症相关细胞因子的产生
•   3.7 HpoR促进细胞凋亡和活性氧的产生
•     3.7.1 HpoR可以促进细胞凋亡
•     3.7.2 HpoR可以促进活性氧（ROS）的产生
• 4 总结与讨论
•   4.1 总结
•   4.2 讨论
•     4.2.1 细菌细胞壁与宿主免疫反应
•     4.2.2 HpoR的转录调控及免疫调节功能
•   4.3 展望
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘璐

导师: 何正国

关键词: 转录调控,胞内生存,细胞凋亡

来源: 华中农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 华中农业大学

分类号: S852.618

DOI: 10.27158/d.cnki.ghznu.2019.000352

总页数: 87

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