米埔红树林根系土壤微生物次级代谢产物对植物致病真菌活性的研究

论文摘要

鉴于红树林微生物及其次级代谢产物的多样性与新颖性,实验室在香港米埔红树林自然保护区采集了土壤样本,本实验对这些土壤样本进行了深入的研究。本实验对老鼠簕根系土壤样本通过稀释平板法分离纯化得到了多种微生物,基于16S rRNA对分离得到的菌株进行了鉴定工作,经过与相关数据库序列信息的比对后,我们将菌株序列中相似度最高的菌属名的相关的分类信息进行了统计归类,建立了一个包含113株细菌的土壤样本菌库,用于后续研究。同时本实验对红树林样本中出现的两株新菌XY-J53T和XY-223T进行了新菌鉴定工作,该部分实验尚在进行中。到现在为止,鲜有红树林天然产物对农业病害防治领域的研究,因此,本次实验我们首先用乙酸乙酯（EA）萃取菌株发酵液获得了菌株的乙酸乙酯粗提物（EA粗浸膏）,用以研究这些细菌次级代谢产物。然后我们筛选了113株菌的粗浸膏对四种植物病原真菌的抑制活性。发现了20株有明显抑制真菌生长活性的细菌。在50μg/mL浓度下,这些活性EA粗浸膏对梨果实和水稻植株的炭疽病和稻瘟病有明显的抑制作用。14种抗菌活性较好的粗提物中,有10种对小球藻的毒性与对照组无显著性差异（25-1μg/mL）,而在相同浓度下,阿米妙收和代森锰锌对小球藻的杀灭率均为34%。这些数据说明了红树林根际细菌的次级代谢产物在未来农业应用中的潜力。然后从活性菌株中对挑选了一株具有广谱抗真菌活性的链霉菌L75,通过大规模发酵（20 L）,富集了7 g的有抑制番茄早疫病菌活性的EA粗浸膏,L75EA粗浸膏在25μg/ml或更低的浓度下,对番茄叶片和根系的生长抑制作用显著优于代森锰锌,对番茄叶片和根系的发育没有明显的负面影响。此外,在相同浓度下,L75 EA粗浸膏的水生毒性明显低于代森锰锌。L75EA粗浸膏的抑制番茄早疫病的作用机理是抑制萌芽管的延伸。对分生孢子的萌发没有影响。液相色谱和质谱仪分析确定了粗浸膏组分中两种已知的抗真菌化合物可能是Alteramide A和HSAF（Heat-Stable Antifungal Factor）。在离体番茄叶片上,在接种了番茄早疫病菌的离体番茄叶片上,涂布50、25和5μg/mL的L75EA粗浸膏,5天后,与对照相比,分别减少了98%、90%和48%的病患区域面积。这进一步印证了红树根际细菌天然产物在农业应用中的潜力。最后,我们从所有样本菌库中随机挑选115株菌,进行PGPR（Plant Growth Promote Rhizobacteria）性状的筛选,本次实验共筛选了4种性状,发现有63株菌对至少一种PGPR性状呈阳性。对红树林菌株样本产生促进植物生长性状的情况进行了初步的了解。随后,对唯一一株四种性状呈阳性的菌株GP3A2进行了活体植物促生实验,其发酵液对植物体促进生长的效果并不明显,有待进一步探索。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
•   1.1 红树林简介
•     1.1.1 红树林的概况
•     1.1.2 生物红树林微生物的特性与生态重要性
•     1.1.3 红树林微生物丰富的次级代谢产物及其潜力
•     1.1.4 红树林特色植物秋茄和老鼠簕
•   1.2 红树林微生物的分类与鉴定
•     1.2.1 基于16SrDNA的菌种鉴定
•     1.2.2 新菌的分类鉴定
•     1.2.3 泥滩杆菌属和硝酸还原菌属
•   1.3 农业病原真菌
•     1.3.1 真菌引发的农作物病害及其影响
•     1.3.2 控制农作物真菌病害的方法
•     1.3.3 以微生物次级代谢产物为基础的“绿色农药”
•   1.4 链霉菌L75（Streptomyces puniceus）
•     1.4.1 链霉菌属简介
•     1.4.2 L75 次级代谢产物的活性和毒性探索
•     1.4.3 次级代谢产物的获取与纯化
•   1.5 促进植物生长的根系土壤细菌（PGPR）
•     1.5.1 PGPR的简介
•     1.5.2 研究和筛选PGPR
• 第2章 红树林根系土壤微生物的分离鉴定
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 培养基
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 主要仪器
•     2.1.4 实验材料
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 红树林根系土壤样本中可培养微生物的分离与鉴定
•     2.2.2 新菌鉴定
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 样本菌库的建立
•     2.3.2 新菌鉴定
•   2.4 讨论与分析
• 第3章 探究可应用于生物农药的红树林根系土壤微生物
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 培养基
•     3.1.2 实验试剂与仪器
•     3.1.3 实验材料
•   3.2 实验方法与过程
•     3.2.1 样本菌库粗浸膏的定量获取
•     3.2.2 对从EA萃取后发酵菌液活性的探究
•     3.2.3 含药板的制备和粗浸膏活性测试
•     3.2.4 在植物上进行的真菌致病性实验
•     3.2.5 粗浸膏毒性测试
•     3.2.6 数据分析
•   3.3 实验结论
•     3.3.1 EA粗浸膏的定量获取
•     3.3.2 使用EA萃取后发酵菌液的活性
•     3.3.3 样品菌株EA粗浸膏的活性筛选
•     3.3.4 在植物上进行的真菌致病性实验
•     3.3.5 粗浸膏毒性测试
•   3.4 实验讨论
• 第4章 L75EA粗浸膏的生物活性与分析化学的研究
•   4.1 实验材料
•     4.1.1 实验用品
•     4.1.2 实验仪器与试剂
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 L75EA粗浸膏抑制植物病原真菌实验
•     4.2.2 L75EA粗浸膏在植物叶子和根部的作用效果
•     4.2.3 L75EA粗浸膏的水生毒性
•     4.2.4 L75EA粗浸膏的作用机理的探究
•     4.2.5 L75 最适发酵时间确定与大规模发酵
•     4.2.6 L75 EA粗浸膏中抗真菌成分的分析化学鉴定
•     4.2.7 在离体叶片上检测L75EA粗浸膏抑制番茄早疫病的活性
•   4.3 实验结论
•     4.3.1 L75EA粗浸膏抑制植物病原真菌实验
•     4.3.2 L75EA粗浸膏在植物叶子和根部的作用效果
•     4.3.3 L75EA粗浸膏的水生毒性
•     4.3.4 L75EA粗浸膏的作用机理
•     4.3.5 最适发酵时间确定与大规模发酵
•     4.3.6 L75 EA粗浸膏中的抗真菌成分
•     4.3.7 通过L75EA粗浸膏抑制番茄早疫病
•   4.4 实验讨论
• 第5章 促进植物生长的根系土壤细菌（PGPR）的初步筛选
•   5.1 实验材料
•     5.1.1 培养基
•     5.1.2 实验试剂
•   5.2 实验方法
•     5.2.1 筛选红树林根系土壤样本菌库中有PGPR性状的菌株
•     5.2.2 在植物上进行的促进生长实验
•   5.3 实验结论
•     5.3.1 筛选红树林根系土壤样本菌库中有PGPR性状的菌株
•     5.3.2 在植物上进行的促进生长实验
•   5.4 实验讨论
•     5.4.1 筛选红树林根系土壤样本菌库中有PGPR性状的菌株
•     5.4.2 在植物上进行的促进生长实验
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间的研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王钰

导师: 徐颖,李艳华

关键词: 红树林根系土壤,病原真菌,活性粗浸膏,促进植物生长根际细菌

来源: 深圳大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,农业基础科学,植物保护

单位: 深圳大学

分类号: S432.44

DOI: 10.27321/d.cnki.gszdu.2019.000650

总页数: 91

文件大小: 2713k

下载量: 62