论文摘要
脂肪酶可以催化水解、酯化、转酯化和酰化反应等。在非水相催化合成中,很多脂肪酶,比如南极假丝酵母脂肪酶B（CalB）,表现出较好的催化活性、立体选择性和操作稳定性;在制药、有机合成、手性化合物拆分、医药中间体等领域得到广泛应用。目前脂肪酶CalB在真核微生物,如米曲酶、毕赤酵母等可进行良好表达,但是真核表达系统操作繁琐,培养菌体生产蛋白周期长。大肠杆菌代谢途径和基因表达调控机制清楚,目的基因表达水平高,培养时间短,是表达蛋白的良好宿主菌。然而,脂肪酶CalB在大肠杆菌中表达时会形成不可溶的包涵体。另外,直接将游离酶投入体系中催化反应会遇到一些问题,例如游离酶不稳定,易受环境因素（比如温度）影响而损失活力;反应结束后,很难将游离酶从体系中分离出来,无法回收再利用。针对以上问题,本论文采用多聚氨基酸修饰CalB的N-,C-两端,通过分子克隆技术构建了重组质粒,重组质粒pCalB-pET21a在大肠杆菌BL21（DE3）中有效表达,获得了可溶、活性较高的脂肪酶pCalB（nH-CalB-10K和6HCalB-10R,n=2,4,6,8）。并且,我们设计的聚氨基酸简单、短小,不需要从蛋白上切除,不会影响脂肪酶的活力。该方法可实现蛋白的可溶表达,因此更多的酶能够被研究应用。自然界中硅藻细胞壁的硅产生组织主要是由硅蛋白（silaffin）形成,硅蛋白的结构特点是带有大量正电荷的多胺链,以及高度磷酸化。硅藻细胞壁的形成过程实现了氧化硅的结构控制和生物大分子的活性维持。受此启发,本论文建立了用脂肪酶pCalB上修饰的聚阳离子氨基酸诱导仿生硅的形成并同时实现pCalB的固定化策略。该固定化方法简单、快速,不需要加入额外的偶联剂,直接依靠pCalB本身所修饰上聚阳离子氨基酸与硅粒子之间的电荷相互作用,就可以有效固定化酶。经过条件优化,最终获得的固定化酶6H-CalB-10K-SPs具有96.8的固定化效率和81.5%的活力回收。我们利用生物相容性好、来源广泛、价格便宜的杨树木粉作为载体,实现了脂肪酶pCalB的共价固定化。本研究中用多聚碱性氨基酸修饰的脂肪酶6HCalB-10K与氧化载体OAP和接枝载体GAP分别进行共价固定。通过对比固定化酶6H-CalB-10K-OAP和6H-CalB-10K-GAP的固定化效果、稳定性和催化性能等,我们发现氧化的木粉载体就可与多聚Lys修饰的酶有效结合且固定化效果不差于接枝的木粉载体,而且比文献报道的固定化效果好、载体处理更简单。该结果为固定化技术的发展提供了一个新思路,通过改造酶而不是载体,实现酶的定向固定化。本论文,我们还将多聚碱性氨基酸修饰的酶pCalB应用到森田-贝里斯-希尔曼反应（MBH反应）的研究中。MBH反应是化学合成中重要的C-C加成反应,其产物烯丙基醇是重要的化学合成中间体,可进一步合成一些医药化合物和复杂的天然产物。传统的化学催化法存在污染环境、反应条件苛刻等问题。目前酶催化MBH反应的报道很少,且文献中指出用脂肪酶催化该反应不容易进行,反应4-6天才获得7%左右的产率。本论文的研究中,我们在磷酸缓冲液中实现了脂肪酶pCalB催化MBH反应,缩短了反应时间,反应12 h就可达到近33%的产率。而且我们首次发现pCalB包涵体也能催化MBH反应,尤其是聚His修饰的pCalB包涵体（6H-CalB-10K）在MBH催化反应中具有明显优势,反应18 h就可获得28%的产率。
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中文摘要abstract缩略词第1章 绪论 1.1 酶的应用与发展 1.1.1 酶的背景介绍 1.1.2 脂肪酶CalB的结构和功能 1.2 脂肪酶的可溶表达研究 1.2.1 CalB在毕赤酵母中的表达 1.2.2 酶在大肠杆菌中的表达 1.2.3 融合标签促进酶的可溶表达 1.2.4 氨基酸修饰促进酶的可溶表达 1.3 脂肪酶的固定化研究 1.3.1 酶固定化方法 1.3.2 固定化载体的选择 1.3.3 生物仿生固定化 1.4 生物催化MBH反应 1.4.1 MBH反应介绍 1.4.2 酶催化MBH反应 1.5 本论文研究目的及意义 参考文献第2章 pCalB的可溶表达研究 2.1 引言 2.2 实验材料 2.2.1 实验仪器 2.2.2 实验试剂 2.3 实验方法 2.3.1 引物设计 2.3.2 质粒提取 2.3.3 pCalB重组质粒构建 2.3.4 pCalB在大肠杆菌中表达 2.3.5 pCalB浓度测定 2.3.6 pCalB活力测定 2.4 实验结果与讨论 2.4.1 建立pCalB可溶表达体系 2.4.2 修饰的氨基酸种类对p Cal B表达的影响 2.4.3 修饰的氨基酸长度对p Cal B表达的影响 2.4.4 诱导条件对p Cal B表达的影响 2.4.5 可溶表达的p Cal B活性比较 2.5 本章小结 参考文献第3章 pCalB的仿生固定化研究 3.1 引言 3.2 实验材料 3.2.1 实验仪器 3.2.2 实验试剂 3.3 实验方法 3.3.1 pCalB酶液制备 3.3.2 pCalB仿生固定化 3.3.3 pCalB浓度测定 3.3.4 pCalB-SPs活力测定 3.3.5 pCalB-SPs结构表征 3.3.6pCalB-SPs稳定性实验 3.3.7pCalB-SPs重复使用性实验 3.3.8 pCalB-SPs催化（R,S）-NEMPAME水解 3.4 实验结果与讨论 3.4.1 多聚氨基酸修饰的CalB仿生固定化 3.4.2 pCalB固定化条件的影响 3.4.3 pCalB-SPs的结构分析 3.4.4 6H-CalB-10K-SPs的稳定性 3.4.5 6H-CalB-10K-SPs的催化性 3.4.6 6H-CalB-10K-SPs的重复使用性 3.5 本章小结 参考文献第4章 pCalB的共价固定化研究 4.1 引言 4.2 实验材料 4.2.1 实验仪器 4.2.2 实验试剂 4.3 实验方法 4.3.1 木粉的预处理 4.3.2 木粉上的官能团修饰 4.3.3 pCalB与木粉共价固定化 4.3.4 pCalB浓度测定 4.3.5 pCalB-OAP和 p Cal B-GAP的活力测定 4.3.6 木粉载体和固定化酶的结构表征 4.3.7pCalB-OAP和 p Cal B-GAP的稳定性实验 4.3.8 pCalB-OAP和 p Cal B-GAP的重复使用性实验 4.4 实验结果与讨论 4.4.1 pCalB的共价固定化 4.4.2 pCalB固定化条件的影响 4.4.3 固定化酶的结构分析 4.4.4 固定化酶的稳定性分析 4.4.6 固定化酶的重复使用性分析 4.5 本章小结 参考文献第5章 pCalB催化MBH反应研究 5.1 引言 5.2 实验材料和方法 5.2.1 实验仪器 5.2.2 实验试剂和材料 5.3 实验方法 5.4 实验结果和讨论 5.4.1 pCalB催化MBH反应的建立 5.4.2 溶剂系统对MBH反应的影响 5.4.3 不同底物对MBH反应的影响 5.4.4 底物摩尔比对MBH反应的影响 5.4.5 反应时间对MBH反应的影响 5.4.6 酶量对MBH反应的影响 5.4.7 pCalB包涵体催化MBH反应研究 5.4.8 pCalB催化MBH反应机制的探究 5.5 本章小结 参考文献第6章 结论与展望 6.1 研究结果 6.2 工作展望作者简介及科研成果致谢
文章来源
类型: 博士论文
作者: 周小雪
导师: 郑良玉
关键词: 南极假丝酵母脂肪酶,多聚氨基酸,可溶表达,仿生固定化,共价固定化,反应
来源: 吉林大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学
单位: 吉林大学
分类号: Q55
DOI: 10.27162/d.cnki.gjlin.2019.000049
总页数: 126
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标签：南极假丝酵母脂肪酶论文; 多聚氨基酸论文; 可溶表达论文; 仿生固定化论文; 共价固定化论文; 反应论文;
