优雅蝈螽生物钟基因cDNA全长克隆及表达研究

论文摘要

昼夜节律是最常见、研究最深入的一类生物节律。模式生物黑腹果蝇Drosophila melanogaster中已鉴定出多个生物钟基因,发现这些基因及其表达产物共同组成的转录-翻译反馈环路构成其生物钟核心分子机制,关于黑腹果蝇以外昆虫的生物钟基因研究较少。优雅蝈螽是1种人们喜闻乐见的鸣虫,其鸣叫具有明显的昼夜节律性,每日早晚各有1个鸣叫高峰。对优雅蝈螽的鸣叫节律调控进行深入研究有助于理解发声昆虫的鸣叫机理,具有较为重要的科学意义。本研究在前期测得优雅蝈螽成体转录组数据的基础上,对period（per）、timeless（tim）、cryptochrome（cry）和clockwork orange（cwo）4个生物钟基因进行3个方面研究。首先,利用RT-PCR、RACE等技术获得上述4个生物钟基因的cDNA全长,并对其序列进行生物信息学分析。然后,通过实时荧光定量PCR研究4个生物钟基因在优雅蝈螽不同发育阶段头部、成虫不同组织中的相对表达量。最后,在3种光周期（自然光周期、L:D=12:12光周期、D:L=12:12黑白颠倒光周期）驯化1周后,分别于0:00、6:00、12:00和18:00解剖取优雅蝈螽雄性成虫头部和精巢进行相对表达量检测。结果如下:1.获得优雅蝈螽生物钟基因per、tim、cry和cwo的完整开放阅读框,分别命名为Ggper、Ggtim、Ggcry和Ggcwo,长度分别为3576 bp、2622 bp、1941 bp和1773 bp,分别编码1191、873、646和590个氨基酸,预测蛋白分子量分别为131.15 kDa、99.53 kDa、74.23 kDa和65.08 kDa,理论等电点pI分别为6.09、6.02、7.57和6.41。氨基酸序列比对发现与其他昆虫生物钟基因一致性高,均在60%以上。结构域分析发现均具有生物钟基因保守的功能域,分别为GgPER的PAS结构域、PAC结构域、PeriodC结构域、核定位信号NLS和细胞质定位信号CLD;GgTIM的TIMELESS结构域、核定位信号NLS、保守区段PER-1和PER-2;GgCRY的DNA-photolyase结构域和FAD-binding-7结构域;GgCWO的HLH结构域和ORANGE结构域。进化分析结果与氨基酸序列比对结果基本一致。以上这些特点均符合生物钟基因的特性,表明本实验克隆获得的4个基因属于优雅蝈螽生物钟基因。2.优雅蝈螽生物钟基因Ggper、Ggtim、Ggcry和Ggcwo的时空表达模式分析结果:4个生物钟基因在雌雄虫体各发育阶段均有表达且差异显著（P<0.05）,若虫期的表达量高于成虫期,推测生物钟基因可能在其若虫期的蜕皮过程中起到重要作用;生物钟基因在雌雄成体不同组织中均有表达且具有显著差异（P<0.05）,同一基因在雌雄成虫中的表达模式基本一致,推测这4个生物钟基因在优雅蝈螽成虫中发挥的作用一致。3.自然光周期条件下,4个生物钟基因在雄性成虫头部中均呈现出明显的昼夜节律性表达,而在精巢中Ggper、Ggtim和Ggcry呈现出明显的昼夜节律性表达,Ggcwo昼夜节律性不明显。改变光周期之后,4个生物钟基因在雄性成虫头部和精巢中均呈现出明显的昼夜节律性表达且Ggcry受光周期影响较明显。另外在自然光周期下,Ggper和Ggtim在雄性成虫头部和精巢中表达趋势一致;在雄性成虫头部Ggcwo呈现昼夜节律并与Ggtim和Ggper的波动趋势基本一致,但在精巢中不具有昼夜节律性。结合4个生物钟基因的序列及其表达模式,本研究初步推测在优雅蝈螽中GgPER和GgTIM结合形成异二聚体并进入细胞核发挥转录抑制作用;GgCRY可能具有光信号传导和转录抑制的双重作用;GgCWO与GgPER和GgTIM协同作用,在头部节律性表达并发挥转录抑制作用。本研究不仅为探究优雅蝈螽鸣叫节律提供了丰富的数据资源,同时也为后期开展生物钟基因功能方面的相关研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 综述
•   1.1 生物节律
•   1.2 昼夜节律
•   1.3 生物钟基因及其分子机制
•     1.3.1 Period
•     1.3.2 Timeless
•     1.3.3 Cryptochrome
•     1.3.4 Clockwork Orange
•     1.3.5 果蝇生物钟分子机制
•   1.4 研究目的及意义
• 第二章 材料与方法
•   2.1 供试虫体
•   2.2 主要试剂
•   2.3 主要仪器
•   2.4 转录组数据整理
•   2.5 总RNA提取
•   2.6 RT-PCR
•     2.6.1 RNA变性及反转录反应
•     2.6.2 中间片段扩增
•   2.7 TA克隆
•   2.8 RACE
•     2.8.1 5′-和 3′-RACE-Ready cDNA合成
•     2.8.2 RACE-PCR
•     2.8.3 回收纯化
•     2.8.4 In-Fusion克隆
•     2.8.5 序列分析生物信息学方法和软件
•   2.9 实时荧光定量PCR
•     2.9.1 引物设计及内参基因
•     2.9.2 实时荧光定量PCR
•     2.9.3 数据分析
• 第三章 优雅蝈螽生物钟基因克隆与序列分析
•   3.1 生物钟基因扩增
•   3.2 生物钟基因序列分析
•     3.2.1 Ggper c DNA序列分析
•     3.2.2 Ggtim c DNA序列分析
•     3.2.3 Ggcry c DNA序列分析
•     3.2.4 Ggcwo c DNA序列分析
•   3.3 结构域分析
•   3.4 二级结构预测分析
•   3.5 三级结构预测分析
•   3.6 分子进化分析
•   3.7 讨论
• 第四章 优雅蝈螽生物钟基因的表达模式分析
•   4.1 实时荧光定量PCR
•     4.1.1 定量片段的确定
•     4.1.2 定量引物的特异性及模板稀释倍数的确定
•   4.2 生物钟基因在不同发育阶段的表达分析
•   4.3 生物钟基因的组织表达谱
•     4.3.1 在不同组织中Ggper的相对表达量
•     4.3.2 在不同组织中Ggtim的相对表达量
•     4.3.3 在不同组织中Ggcry的相对表达量
•     4.3.4 在不同组织中Ggcwo的相对表达量
•   4.4 不同光周期下雄性成虫生物钟基因的昼夜表达模式
•     4.4.1 不同光周期头部生物钟基因的昼夜表达模式
•     4.4.2 不同光周期精巢生物钟基因的昼夜表达模式
•   4.5 讨论
• 第五章 展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间取得的科研成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 韩媛吕

导师: 常岩林,周志军

关键词: 优雅蝈螽,生物钟基因,实时荧光定量,昼夜表达模式

来源: 河北大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 河北大学

分类号: Q78

总页数: 95

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