Cytophaga hutchinsonii纤维素降解相关基因chu0922及chu2830功能的研究

论文摘要

纤维素作为一种产量丰富的清洁能源,已经被越来越多的国家用来作为石油等化石能源的替代资源。自然界中主要凭借微生物的分解作用使纤维素腐烂,从而进一步被水解成单糖被利用。纤维素由于含有结晶区和非结晶区两部分而不容易被微生物利用,主要是因为结晶区存在多种分子间作用力,使其结构十分紧密。而各种纤维素酶却能通过合作或者组合成一个复合体的形式巧妙地解决这一难题。Cytophaga hutchinsonii分布范围较大,是一种细长杆状的革兰氏阴性菌,主要以纤维素为营养来源。特殊的是,C.hutchinsonii不编码可以水解纤维素结晶区的外切纤维素酶,并且它含有的内切纤维素酶缺少能结合纤维素的CBM结构域。在C.hutchinsonii表面也没有观察到类似纤维小体的结构。C.hutchinsonii通过接触来直接感应纤维素的存在,从而启动降解程序。因此推测该菌存在第三种纤维素降解机制,但是这种降解机制的具体功能仍未解释清楚。经过数位研究者多年的探索,C.hutchinsonii的遗传操作体系得到了建立并进行了完善,许多重要的功能基因相继被发现和研究,丰富了人们对C.hutchinsonii的认识。本文成功筛选到一些重要的基因,并详细研究了其中两个突变株的表型,最后初步探讨了突变株影响纤维素降解的机制的原因。具体研究内容如下:1.chu0922基因功能的研究随机插入突变长出了一个不能降解纤维素的突变株,转座子具体的插入失活位点鉴定为chu0922。利用同源双交换的方法将该基因敲除后得到的转化子与插入突变得到突变株的表型相同,都不能在滤纸上生长。RT-PCR验证后发现该基因缺失后并不影响其上下游基因的正常转录,证明该表型确实是由chu0922缺失导致的。chu0922编码一个未知功能蛋白,其基因序列包含信号肽及T9SS蛋白分泌系统识别的信号序列CTD,所以,我们推测CHU0922可能是T9SS的底物蛋白,经过T9SS被分泌到细胞外。进一步分析突变株△0922在各种碳源中的生长,发现A0922可以在glucose、cellobiose中正常生长,RAC中突变株表现出了长达72 h的生长延滞期,而在Avicel中则完全不生长,说明无定型纤维素及结晶纤维素不能正常被△0922利用。观察突变株在PY2表面的扩散情况发现,chu0922的缺失导致单个菌体的运动能力及菌落的扩散情况都出现了缺陷。用扫描电子显微镜（SEM）观察菌体处理后的纤维素样品发现,WT处理后的纤维素表面整齐光滑,而突变株处理后的纤维素表面粗糙,与未经菌体处理的纤维素表面差异不大。通过XRD检测纤维素样品的结晶度,发现经过WT菌株处理后的纤维素结晶度降低,而纤维素被突变株A0922降解后,结晶度呈现出上升的趋势。这表明A0922对纤维素的利用具有一定选择性,它只利用了松散的无定型区域,对结晶区的降解似乎非常吃力。质谱鉴定突变株的外膜差异蛋白发现,chu0922的缺失导致一些外膜蛋白的表达水平降低,如CHU1276,CHU1277,CHU1279。提取突变株的mRNA进行RT-qPCR检测 chu1276-1279 的转录水平发现,chu1277,chu1278,chu1278 chu1279在突变株中的转录水平较WT来说显著降低,且chu1276与chu1277这一下调趋势在RAC培养条件下更加明显。前期研究表明,CHU1276缺失后会导致菌体完全不能降解纤维素,并且菌体对低浓度的葡萄糖或纤维二糖的利用也出现了明显的缺陷;CHU1277失活后使突变株不能利用纤维素及纤维寡糖。它们对C.hutchinsonii来说是其正常发挥功能的关键基因。但是后续研究发现,单独提高chu1276-1279中的任何一个基因的表达水平都不能恢复突变株对滤纸的降解能力。设置梯度浓度的glucose底物来培养C.hutchinsoni 发现,从生长速率来看,WT菌株的生长速率不随条件变化而改变,但A0922的生长速率却随着葡萄糖浓度的降低而减小;相同的是,WT和突变株的最大生物量都随着糖浓度的升高而增加。检测休止状态的细胞对葡萄糖的吸收发现,突变株A0922的休止细胞对0.1%及0.4%的葡萄糖吸收几乎与WT 一致。在Stanier琼脂培养基中加入0.1%的葡萄糖后,再进行滤纸降解,发现此时突变株可以使滤纸变黄,仍然不能降解结晶纤维素。2.chu2830基因功能的研究筛菌过程中发现一个能降解滤纸,但速度较慢的突变株,经比对发现转座基因破坏了chu2830的基因序列。chu2830编码一个位于细胞质膜的带有TPR重复的未知功能蛋白,该基因的缺失导致菌体对纤维素的利用速度变慢,且突变株的运动能力出现缺陷。我们进一步分析△2830在不同碳源条件下的生长曲线,发现突变株在葡萄糖、纤维二糖为唯一碳源时,生长能力不受影响,生长速率及最大生物量甚至要高于野生型菌株。但是当以无定型纤维素及结晶纤维素为唯一碳源时,突变株的生长出现了明显延滞,导致对纤维素的利用速度显著变慢。通过对突变株菌体表面及全细胞的纤维素酶及β-葡萄糖苷酶的酶活检测发现,chu2830的缺失几乎不影响纤维素降解相关酶活。当分别用RAC及Avicel对突变株菌体进行诱导后再在纤维素培养基中培养,发现延滞期消失。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写词表
• 第一章 研究背景
•   1.1 纤维素的开发和利用
•   1.2 纤维素的结构
•   1.3 纤维素的微生物降解
•   1.4 Ⅸ型分泌系统
•   1.5 Cytophaga hutchinsonii的研究背景及现状
•   1.6 论文立题及工作思路
• 2830功能的初步研究'>第二章 转座子插入突变及chu₂830功能的初步研究
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 菌种及质粒
•     2.1.2 实验中用到的引物
•     2.1.3 主要试剂及仪器
•     2.1.4 常用培养基
•     2.1.5 转座子插入突变
•       2.1.5.1 转座子插入突变筛选纤维素降解缺陷菌株
•       2.1.5.2 转座子插入位点的鉴定
•     2.1.6 滤纸降解实验
•     2.1.7 PY2软琼脂、硬琼脂表面的扩散
•     2.1.8 E.coli感受态的制备与热激转化
•       2.1.8.1 E.coli感受态的制备
•       2.1.8.2 热激转化
•     2.1.9 C.hutchinsonii感受态细胞的制备与电击转化
•       2.1.9.1 C.hutchinsonii感受态细胞的制备
•       2.1.9.2 电击转化
•     2.1.10 生长曲线的测定
•     2.1.11 纤维素底物利用率的测定
•     2.1.12 纤维素酶活的测定
•   2.2 结果
•     2.2.1 转座子插入突变得到滤纸降解缺陷株
•     2.2.2 生物信息学分析
• 2830基因功能的研究'>    2.2.3 chu₂830基因功能的研究
•       2.2.3.1 △2830的构建及表型验证
•       2.2.3.2 生物信息学分析
• 2830的缺失导致菌体降解纤维素的速度显著变慢'>      2.2.3.3 chu₂830的缺失导致菌体降解纤维素的速度显著变慢
• 2830的缺失不影响菌体的纤维素酶的酶活'>      2.2.3.4 chu₂830的缺失不影响菌体的纤维素酶的酶活
•   2.3 讨论
• 0922基因功能的研究'>第三章 chu₀922基因功能的研究
•   3.1 材料和方法
•     3.1.1 菌种及质粒
•     3.1.2 实验中用到的引物
•     3.1.3 主要试剂及仪器
•     3.1.4 常用培养基及试剂的配制方法
• 0922'>    3.1.5 基因敲除chu₀922
• 0922的回补'>    3.1.6 chu₀922的回补
•     3.1.7 滤纸降解实验
•     3.1.8 PY2软琼脂小培养、PY2硬琼脂表面的扩散实验
•     3.1.9 E.coli感受态的制备与热激转化
•     3.1.10 C.hutchinsonii感受态细胞的制备与电击转化
•     3.1.11 再生无定型纤维素（RAC）的制备
•     3.1.12 生长曲线的测定
•     3.1.13 纤维素底物利用率的测定
•     3.1.14 蛋白浓度的测定（考马斯亮蓝法）
•     3.1.15 扫描电子显微镜（SEM）观察纤维素表面形态
•     3.1.16 XRD测定纤维素结晶度
•     3.1.17 纤维素酶活性的测定
•     3.1.18 RT-PCR
•       3.1.18.1 RNA的提取
•       3.1.18.2 RNA的反转录
•       3.1.18.3 PCR反应
•     3.1.19 RT-qPCR
•       3.1.19.1 RNA的提取及反转录
•       3.1.19.2 荧光定量PCR
•       3.1.19.3 数据处理
•     3.1.20 蛋白的异源表达与纯化
•       3.1.20.1 目的蛋白的异源表达
•       3.1.20.2 目的蛋白的纯化
•       3.1.20.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
•     3.1.21 蛋白的定位
•       3.1.21.1 菌体各组分蛋白样品的提取与制备（4℃）
•       3.1.21.2 蛋白免疫印迹杂交（Western blot）
•     3.1.22 休止细胞对葡萄糖的吸收实验
•   3.2 结果
•     3.2.1 线性同源双交换验证纤维素降解缺陷株
•     3.2.2 生物信息学分析
• 0922的缺失导致菌体的运动能力出现缺陷'>    3.2.3 chu₀922的缺失导致菌体的运动能力出现缺陷
• 0922的缺失影响了菌体对结晶纤维素的降解'>    3.2.4 chu₀922的缺失影响了菌体对结晶纤维素的降解
•       3.2.4.1 生长曲线分析
•       3.2.4.2 SEM检测纤维素表面形态
•       3.2.4.3 X-射线衍射法检测纤维素的结晶度
• 0922的缺失影响了部分纤维素酶的活性'>    3.2.5 chu₀922的缺失影响了部分纤维素酶的活性
• 0922的缺失影响了部分外膜蛋白的表达水平'>    3.2.6 chu₀922的缺失影响了部分外膜蛋白的表达水平
• 0922的缺失不影响胞外蛋白的分泌'>    3.2.7 chu₀922的缺失不影响胞外蛋白的分泌
• 0922的缺失影响了chu₁276-1280的转录水平'>    3.2.8 chu₀922的缺失影响了chu₁276-1280的转录水平
• 0922的缺失影响了菌体对葡萄糖的利用'>    3.2.9 chu₀922的缺失影响了菌体对葡萄糖的利用
•     3.2.10 添加低浓度的葡萄糖不能恢复突变株对结晶纤维素的利用
• 1276-1279中的任何一个基因并不能恢复突变株对纤维素的利用'>    3.2.11 单独回补chu₁276-1279中的任何一个基因并不能恢复突变株对纤维素的利用
•   3.3 讨论
• 全文总结及展望
• 附录
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 苏亚茹

导师: 张为灿,卢雪梅

关键词: 转座子插入突变,纤维素降解,外膜蛋白,纤维素结晶区,葡萄糖吸收

来源: 山东大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,环境科学与资源利用

单位: 山东大学

分类号: X705;Q78

总页数: 88

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