导读:本文包含了融合鞭毛论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:猪圆环病毒2型,鞭毛蛋白,分子佐剂,原核表达
融合鞭毛论文文献综述
程健[1]（2018）在《创伤弧菌鞭毛蛋白、PCV2 Cap蛋白的融合表达及免疫应答研究》一文中研究指出猪圆环病毒2型(PCV2)是引起猪圆环病毒病(PCVD)的主要病原,引起猪的免疫抑制并能与其它病原微生物继发感染,给养猪业带来巨大的经济损失。Cap蛋白是其主要的开放阅读框ORF2编码的,是PCV2的免疫原性蛋白及主要的结构蛋白,在流行病学诊断及疫苗学研究中起着至关重要的作用。细菌鞭毛蛋白是TLR5的唯一配体,创伤弧菌鞭毛蛋白FlaB具有良好的分子佐剂作用。ELK16自聚肽融合标签能在菌体内形成类包涵体,其融合蛋白可用离心洗涤法纯化。本研究利用生物信息学软件,将FlaB、PCV2 Cap基因序列优化成大肠杆菌偏爱密码子序列,将合成序列克隆入自聚肽ELK16融合表达载体pET-ELK16,将重组载体 pELK16-FlaB-Cap、pELK16-FlaB 和 pELK16-Cap 转化 BL21(DE3)大肠杆菌,用IPTG诱导融合蛋白表达。SDS-PAGE分析结果显示,叁种融合蛋白均以类包涵体表达,经0.5%Triton X-100离心洗涤后,ELK16-FlaB-Cap融合蛋白的纯度达90%,产量达92mg/L;ELK16-FlaB融合蛋白的纯度达96%,产量达105mg/L;ELK16-Cap融合蛋白的纯度达93%,产量达92mg/L。分别用ELK16-Cap + IFA(弗氏不完全佐剂)、ELK16-Cap + ELK16-FlaB 和 ELK16-FlaB-Cap 免疫小鼠,初免后 7、14、21 和 28 天采血,用间接ELISA进行抗体检测,结果显示初免后7天,叁个免疫组即为ELISA抗体检测阳性,随后抗体水平呈逐渐上升趋势,其中ELK16-Cap+ELK16-FlaB免疫组的抗体水平最高,IFA + ELK16-Cap免疫组次之,ELK16-FlaB-Cap免疫组抗体水平最低。二免后14天取小鼠脾脏淋巴细胞,分别用ConA(5μg/mL)和Cap(10μg/mL)刺激,用试剂盒检测细胞因子表达。结果与对照组相比,免疫组的TNF-α、IL-12和IFN-y表达水平明显上升,其中Cap刺激组TNF-α显著高于ConA刺激组,两组IL-12和IFN-y水平相当。这些研究结果表明,ELK16-FlaB对PCV2 Cap蛋白ELISA抗体产生的具有刺激作用显,ELK16-FlaB-Cap的刺激作用相对较弱;ELK16-FlaB-Cap对刺激IL-12产生的作用较强,ELK16-FlaB对刺激TNF-α和IFN-y产生的作用较强。为了优化PCV2重组亚单位疫苗和比较纯化标签对FlaB免疫刺激作用的影响,将PCV-2a、PCV-2d、PCV-2e中和抗原表位与PCV-2bCap基因串联,与His标签融合表达,并将His标签与FlaB基因进行表达融合,利用亲和层析纯化融合蛋白。再将FlaB基因与ELP(类弹性蛋白多肽)进行融合表达,利用相变循环纯化重组蛋白。将36只小鼠分为6组,分别为 PBS 对照组、His-4Cap 免疫组、His-4Cap + ELP-FlaB 免疫组、His-4Cap + His-FlaB免疫组、His-4Cap + ELK16-FlaB免疫组和His-4Cap + IFA免疫组。初免后7、14、21和28天采血,用间接ELISA测定Cap蛋白特异抗体;二免后14天取小鼠脾脏淋巴细胞,用ConA或His-4Cap刺激后检测细胞因子表达。二免后14天,每组3只小鼠用103个TCID50 PCV2攻毒,攻毒后3天和7天取小鼠血清进行病毒血症检测。结果在初免后第7天,His-4Cap + ELP-FlaB即为ELISA抗体检测阳性,其他四组为抗体检测阴性;从初免后14天,抗体水平呈上升趋势;在初免后21天,4个免疫组的抗体水平明显上升,其中His-4Cap+ His-FlaB免疫组的抗体水平最高。与对照组相比,五个免疫组的TNF-α、IL-12和IFN-y表达水平明显上升,His-4Cap刺激组的TNF-α水平高于ConA刺激组IL-12和IFN-y水平相当。这些研究结果表明,His、ELP和ELK16标签对FlaB刺激PCV2重组Cap蛋白ELISA抗体产生无明显影响,叁种标签融合表达的FlaB均能刺激小鼠产生TNF-α、IL-12和IFN-γ表达,其中ELK16-FlaB的刺激作用较强。5个免疫组的小鼠血清病毒载量均下降,His-4Cap+ELP-FlaB免疫组的病毒载量最低。(本文来源于《扬州大学》期刊2018-05-01）
张丽娟[2]（2016）在《铜绿假单胞菌外膜蛋白F及B型鞭毛蛋白与VP22融合DNA疫苗免疫效力和感染保护作用的研究》一文中研究指出目的:评价I型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus 1,HSV-1)间层蛋白VP22能否增强铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)外膜蛋白F(the outer membrane protein F,OprF)及B型鞭毛蛋白(type B flagellins,FlaB)的体液、细胞免疫效力和感染保护作用。方法:1.动物免疫:(1)提取DNA疫苗pVAX1-VP22、pVAX1-OprF、pVAX1-OprF-VP22、pVAX1-FlaB、pVAX1-FlaB-VP22;(2)用体内转染试剂介导将疫苗肌肉注射BALB/c小鼠,免疫叁次后制备小鼠抗血清,分离脾脏T淋巴细胞。2.体液免疫:间接ELISA检测IgG1与IgG2a抗血清效价的比值。3.细胞免疫:(1)CCK-8检测T淋巴细胞的增殖活性;(2)ELISPOT检测细胞因子IFN-γ和IL-4分泌水平。4.感染保护实验:(1)腹腔注射PA于FlaB/VP22疫苗免疫后的BALB/c小鼠,构建铜绿假单胞菌肺部感染模型,一周后分离肺组织;(2)肺组织匀浆活菌计数评价肺部PA感染程度;(3)HE染色观察肺组织病变情况。结果:1.体液免疫:间接ELISA结果显示,pVAX1-OprF-VP22、pVAX1-OprF、pVAX1-FlaB-VP22和pVAX1-FlaB组小鼠血清均产生了特异性IgG1、IgG2a抗体,而pVAX1-VP22组和PBS组则为阴性。pVAX1-OprF-VP22组抗血清效价IgG2a/IgG1的比值显着高于pVAX1-Opr F组(P<0.05),pVAX1-FlaB-VP22组抗血清效价IgG2a/IgG1的比值显着高于pVAX1-FlaB组(P<0.05),Th细胞免疫应答分型倾向于Th1型。2.细胞免疫:(1)CCK-8检测T淋巴细胞的增殖活性,pvax1-oprf-vp22组刺激指数(si)显着高于pvax1-oprf组(p<0.05),pvax1-oprf组显着高于pvax1-vp22组和阴性对照(pbs)组,pvax1-vp22组与阴性对照(pbs)组之间无显着差异(p>0.05);pvax1-flab-vp22组刺激指数(si)显着高于pvax1-flab组(p<0.05),pvax1-flab组显着高于pvax1-vp22组与阴性对照(pbs)组,pvax1-vp22组与阴性对照(pbs)组之间无显着差异(p>0.05)。(2)elispot检测可分泌ifn-γ和il-4的t淋巴细胞数目,pvax1-oprf-vp22组分泌ifn-γ的t细胞显着高于pvax1-oprf组,pvax1-oprf组显着高于pvax1-vp22组和阴性对照(pbs)组,pvax1-vp22组与阴性对照(pbs)组之间无显着差异(p>0.05);pvax1-flab-vp22组分泌ifn-γ的t细胞数显着高于pvax1-flab组(p<0.05),pvax1-flab组显着高于pvax1-vp22组与阴性对照(pbs)组,pvax1-vp22组与阴性对照(pbs)组之间无显着差异(p>0.05)。所有免疫组分泌il-4的t细胞数都很低。3.感染保护实验:(1)肺组织匀浆活菌计数结果显示,pvax1-flab-vp22组显着低于pvax1-flab组(p<0.05),pvax1-flab组显着低于pvax1-vp22组与阴性对照(pbs)组,pvax1-vp22组与阴性对照(pbs)组之间无显着差异(p>0.05)。(2)肺组织病理he染色切片显微镜下可观察到,pvax1-vp22组和pbs对照组肺组织感染严重,肺泡结构消失,间质增生,支气管腔内大量组织坏死。pvax1-flab组肺泡结构较完整,支气管腔和间质内有中性粒细胞、浆细胞等大量炎症细胞浸润。pvax1-flab-vp22组可见部分红细胞产生,有充血现象。结论:1.vp22可显着增强单表达抗原oprf与flab的在小鼠体内诱导特异性体液和细胞免疫反应的效力,且更倾向于细胞免疫(th1型)。2.腹腔注射可成功建立铜绿假单胞菌肺部感染模型,VP22与FlaB融合表达的DNA疫苗可在一定程度上预防PA感染。(本文来源于《川北医学院》期刊2016-05-01）
李小姣,秦婷婷,杨春,刘瑞熙,杨硕[3]（2015）在《含人巨细胞病毒糖蛋白B中AD2位点Ⅰ的鞭毛融合蛋白在小鼠中的免疫应答》一文中研究指出目的探讨人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)糖蛋白B(glycoprotein B,g B)中AD2位点Ⅰ(AD-2S1)在小鼠中的免疫效果。方法将AD-2和4×AD-2S1核酸序列分别克隆至含有鞭毛蛋白的质粒p ET42b-Flj B中,构建表达载体p ET/Flj B-AD-2和p ET/Flj B-4×AD-2S1,转化大肠埃希菌Rosetta 2(DE3),IPTG诱导表达,收集Flj B-AD-2的菌体裂解液上清及Flj B-4×AD-2S1的菌体裂解液沉淀,经Superdex-200凝胶过滤层析纯化,根据蛋白含量及纯度配制无佐剂抗原(Flj B-AD-2和Flj B-4×AD-2S1)及含Al(OH)3佐剂抗原[Flj B-AD-2+Al(OH)3和Flj B-4×AD-2S1+Al(OH)3]。用制备的抗原于第0和21 d皮下免疫BALB/c小鼠,设PBS对照组,于2次免疫后1周,眼窝后穿刺采血,分离血清,ELISA法检测AD-2S1特异性Ig G及Ig G1和Ig G2a水平,中和试验检测HCMV中和抗体水平。结果纯化的Flj B-AD-2抗原相对分子质量约54 000,纯度为88.2%,蛋白含量为0.91 mg/ml;纯化的Flj B-4×AD-2S1抗原相对分子质量约50 000,纯度为96.8%,蛋白含量为0.45 mg/ml。与对照组相比,免疫组小鼠均产生不同水平的抗AD-2S1特异性Ig G抗体,Flj B-AD-2和Flj B-AD-2+Al(OH)3免疫组小鼠Ig G水平较低,Flj B-4×AD-2S1和Flj B-4×AD-2S1+Al(OH)3免疫组小鼠Ig G水平较高,其中Flj B-4×AD-2S1与Flj B-AD-2免疫组相比,差异有统计学意义(P<0.05);Flj B-4×AD-2S1可诱导小鼠产生Ig G1和Ig G2a两种抗体,但Ig G2a水平较高,差异有统计学意义(P<0.05),而Flj B-4×AD-2S1+Al(OH)3诱导小鼠产生的Ig G1和Ig G2a水平差异无统计学意义(P>0.05);各免疫组小鼠血清中和抗体水平均不高于1∶4。结论 Flj B-4×AD-2S1和Flj B-AD-2均能诱导产生AD-2S1特异性Ig G,却不能诱导小鼠产生补体非依赖性中和抗体。(本文来源于《中国生物制品学杂志》期刊2015年05期）
王燕[4]（2015）在《铜绿假单胞菌外膜蛋白F及B型鞭毛蛋白与VP22融合DNA疫苗体液免疫效应的研究》一文中研究指出目的:评价I型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus 1,HSV-1)间层蛋白VP22能否增强铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,Pa)外膜蛋白F(the outer membrane protein F,Opr F)与B型鞭毛蛋白(type B flagellins,Fla B)体液免疫效力,为进一步研究VP22分子与Pa抗原分子融合的DNA疫苗奠定基础。方法:1.提取DNA疫苗p VAX1-Opr F、p VAX1-VP22-Opr F、p VAX1-Opr F-VP22、p VAX1-Fla B、p VAX1-Fla B-VP22、p VAX1-VP22;2.用体内转染试剂介导将疫苗肌肉注射BALB/c小鼠,免疫叁次后制备小鼠抗血清;3.通过Western blot检测抗血清与抗原蛋白结合的特异性;4.间接Elisa检测抗血清效价,用方差分析/t检验的统计学方法分析抗血清效价的组间差异。结果:1.Western blot结果显示p VAX1-Opr F、p VAX1-VP22-Opr F、p VAX1-Opr F-VP22免疫组小鼠抗血清均能特异性结合Opr F;p VAX1-Fla B和p VAX1-Fla B-VP22免疫组小鼠抗血清均能特异性结合Fla B。2.间接Elisa结果表明p VAX1-Opr F-VP22组抗体Ig G效价显着高于p VAX1-Opr F和p VAX1-VP22-Opr F组(P<0.05),而p VAX1-Opr F组和p VAX1-VP22-Opr F组之间无显着差异(P>0.05);p VAX1-Fla B-VP22组抗血清Ig G效价水平显着高于p VAX1-Fla B组(P<0.05)。结论:单表达抗原(Opr F与Fla B)的DNA疫苗以及抗原与VP22融合表达的DNA疫苗均能在小鼠体内诱导特异性体液免疫反应;抗原(Opr F与Fla B)与VP22分子N-端融合表达能显着增强DNA疫苗的体液免疫效力。(本文来源于《川北医学院》期刊2015-05-01）
卓晓琴[5]（2014）在《包含艰难梭菌毒素A和B非毒性域及鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白的重组融合蛋白疫苗》一文中研究指出艰难梭菌是一种芽胞杆菌,可产生毒素介导性疾病。艰难梭菌表达2种主要毒力因子,即毒素A(TcdA)和毒素B(TcdB)。在人类和动物研究中结果表明,人类抗这些毒素的免疫力与抗艰难梭菌感染(CDI)明确相关,已知TcdA和TcdB的受体结合域(RBDs)是具免疫原性的。在本项研究中,我们检测了鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白(FliC)亚单位D1作为先天免疫激动剂,在小鼠模型中作为重组融合疫苗表达的靶向TcdA和TcdB的RBDs的免疫佐剂特性。经腹腔免疫的小鼠在血清中出现了明显的抗TcdA和抗TcdB的IgG。在能够密切体现人类疾病的CD1小鼠模型中进行了重组疫苗(加或不加佐(本文来源于《微生物学免疫学进展》期刊2014年03期）
赵达,王鹤,梁宏儒,胡旭,姜东君[6]（2014）在《金黄色葡萄球菌GapC蛋白与鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白的融合表达及其活性》一文中研究指出目的在大肠埃希菌中融合表达金黄色葡萄球菌(Staphylococcus.aureus,S.aureus)GapC蛋白与鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白,并检测其甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)活性。方法采用PCR技术分别扩增鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白flic基因和S.Aureus GapC基因,通过overlap PCR将这两段基因拼接并克隆至载体pQE30a,构建重组表达质粒pQE30-flic-GapC,将重组表达质粒转化E.coli XL-blue,IPTG诱导表达,表达产物经镍柱亲和层析试剂盒纯化后,进行SDS-PAGE及Western blot分析,并检测其GAPDH活性。结果重组表达质粒pQE30-flic-GapC经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达产物相对分子质量约95 000,最佳诱导表达时间为5 h,主要以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的31.4%;纯化产物可与小鼠抗S.aureus全菌体多抗血清和抗鼠伤寒沙门菌全菌体多抗血清发生特异性反应,GAPDH活性为(0.337±0.019)。结论成功表达并纯化了具有较高生物学活性的flic-GapC融合蛋白,为S.aureus亚单位疫苗的研究奠定了基础。(本文来源于《中国生物制品学杂志》期刊2014年02期）
包琦锋,刘洪洋,张婷,陈雪,许雪梅[7]（2014）在《鞭毛蛋白FliC突变体/HPV 18 L2N融合蛋白的表达与纯化》一文中研究指出目的:人乳头瘤病毒(HPV)的持续性感染导致女性宫颈癌的发生。HPV的次要衣壳蛋白L2可以诱发交叉中和多种型别HPV的中和抗体,但是单独免疫L2诱发的抗体滴度较低。鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白FliC是一种有效的佐剂。删除FliC超变区域的突变体可与外源抗原融合表达并且显着增强外源抗原特异性抗体的产生。本研究旨在构建鞭毛蛋白FliC超变区删除突变体与HPV 18 L2N(aa.13-154)的融合基因,通过大肠杆菌原核表达系统表达FliC突变体与HPV 18 L2N的融合蛋白并纯化,为研究鞭毛蛋白的佐剂活性及新型HPV 18L2疫苗奠定基础。方法:以鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白编码基因fliC为模板,通过重迭PCR法构建删除fliC D3区域(fliC△D3)、D3+CD2a区域(fliC△D3CD2a)、D3+D2区域(fliC△D2D3)的突变体,同时将HPV 18 L2N基因插入置换突变体的超变区删除区域。含有重组基因的表达载体在大肠杆菌中诱导表达,经SDS-PAGE及Western blot鉴定分析。表达的融合蛋白经Ni-Sepharose亲和层析纯化及Q-Sepharose离子交换层析去除内毒素。纯化后的融合蛋白经Native-PAGE鉴定分析,通过鲎试剂凝胶法测量蛋白溶液中的内毒素含量。结果:构建了pET22b-fliC△D3/18 L2N、pET22b-fliC△D3CD2a/18L2N、pET22b-fliC△D2D3/18 L2N重组载体。重组载体在大肠杆菌以包涵体形式高效表达,且主要以单体形式存在。结论:通过原核表达及层析法纯化,成功获得了无热源、高纯度的鞭毛蛋白FliC突变体与HPV 18 L2N的融合蛋白,为增强HPV L2免疫原性提供了一种新的途径,为进一步研制HPV 18 L2疫苗奠定了基础。(本文来源于《现代生物医学进展》期刊2014年01期）
于波[8]（2013）在《类鼻疽杆菌鞭毛蛋白FliC与肠出血性大肠杆菌蛋白EspA的融合表达及其免疫学性质研究》一文中研究指出类鼻疽(Melioidosis)疾病是由类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia pseudomallei）引起的一种热带亚热带地区人畜共患传染病。由于类鼻疽病易感动物的广谱性、疾病的高致死性以及流行范围不断扩大的趋势，该病已经成为全球的公共卫生问题。类鼻疽伯克霍尔德菌是一种革兰氏阴性杆菌，有极高的感染性和对环境的极强的抵抗能力，已被美国疾病控制和预防中心列为B类生物战剂。此外临床上类鼻疽杆菌感染的多重耐药菌性，使得其感染的治疗是异常困难。因此发展新的预防和治疗策略非常重要。疫苗是预防和控制感染性疾病有效、经济的手段。就类鼻疽杆菌疫苗研究而言，已经有很多研究就全菌灭活疫苗、成份疫苗、结合疫苗等方面进行了尝试，但目前还没有一种应用于临床。重组亚单位疫苗是通过重组表达能够有效刺激机体产生具有保护性免疫反应的抗原分子(主要是蛋白抗原)，从而达到预防和控制疾病的目的。亚单位疫苗因为其成份清楚、质量可控、成本较低，已经成为新型疫苗发展的重要方向。鞭毛蛋白(flagellin, FliC)作为细菌表面主要抗原，其氨基酸序列高度保守，是引起免疫反应的重要抗原成份之一，已广泛用于该细菌感染的诊断，并可作为亚单位疫苗的候选抗原成份。本文分别采用pET22b、pET28a以及pGEX载体进行FliC的表达，结果均不理想。课题组前期在研究肠出血性大肠杆菌(EHEC) O157:H7的Ⅲ型分泌系统重要元件(Escheriochia coli secret protein A，EspA)的功能时发现其具有促进外源蛋白表达的作用，并构建了基于EspA的表达载体pEspA。本研究拟采用该表达系统重组表达类鼻疽杆菌鞭毛蛋白FliC与EHEC O157:H7EspA融合蛋白，并评价其免疫学性质，为发展针对类鼻疽杆菌和EHEC O157:H7的二联疫苗奠定基础。方法1bpsl3319基因的克隆和重组表达质粒的构建以类鼻疽杆菌BPC006基因组DNA为模板，PCR扩增FliC编码基因bpsl3319，通过DNA重组技术连接到不同表达质粒pET22b(+)、pET28a (+)、pGEX和pEspA，酶切后测序鉴定阳性重组子，转入大肠杆菌BL21，获得重组表达工程菌。2重组蛋白EspA-FliC的表达和纯化重组工程菌pEspA-FliC经IPTG诱导剂诱导后，超声破菌，SDS-PAGE电泳分析重组蛋白EspA-FliC表达形式。EspA-FliC融合蛋白经过包涵体洗涤、使用阴离子交换层析和凝胶过滤层析，纯化后产物超滤离心浓缩，采用BCA法测定蛋白浓度。3融合蛋白EspA-FliC免疫学性质研究3.1融合蛋白的反应性检测Western blot检测融合蛋白与类鼻疽杆菌多抗和EspA单克隆抗体、EspA多抗免疫反应性。3.2融合蛋白的免疫原性检测纯化的融合蛋白免疫Balb/c小鼠，ELISA方法检测血清特异性抗体的滴度；并通过Western blot检测免疫血清与类鼻疽杆菌全菌、融合蛋白及EspA的反应性。结果1成功克隆了类鼻疽杆菌FliC编码基因bpsl3319，并构建了重组表达质粒pET22b-bpsl3319、pET28a-bpsl3319、pGEX-bpsl3319和pEspA-bpsl3319，FliC在前叁种表达系统中未见明显表达，仅在pEspA系统获得高效表达。2重组工程菌pEspA-FliC/BL21经过IPTG诱导后，融合蛋白EspA-FliC表达量约占菌体总蛋白的35％，纯化后蛋白纯度大于85％。3EspA-FliC能分别与抗类鼻疽杆菌多克隆抗体、抗EspA的单抗或多抗血清发生特异性抗原抗体反应，表现出良好的免疫反应性。4EspA-FliC免疫Balb/c小鼠可刺激其产生高效价特异的IgG，而且此抗体能识别EspA-FliC、EspA以及天然类鼻疽杆菌的FliC，表现出良好的免疫原性。结论本研究采用DNA重组技术成功表达了具有良好免疫原性和免疫反应性的类鼻疽杆菌鞭毛蛋白FliC与肠出血性大肠杆菌EspA的融合蛋白，为研制类鼻疽杆菌和肠出血性大肠杆菌O157：H7的二联疫苗奠定了基础。(本文来源于《第叁军医大学》期刊2013-04-01）
于波,方瑶,顾江,王海光,程琰[9]（2013）在《类鼻疽杆菌鞭毛蛋白FliC与EHEC O157∶H7 EspA蛋白的融合表达及其免疫学性质研究》一文中研究指出目的融合表达类鼻疽杆菌鞭毛蛋白FilC与肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157 EspA蛋白,并评价其免疫学性质。方法 PCR扩增类鼻疽杆菌FilC编码基因bpsl3319,连接到基于EHEC O157 EspA的表达载体pEspA上,表达并纯化EspA-FliC融合蛋白,Western blot分析其抗原性;EspA-FliC免疫Balb/c小鼠评价其免疫原性。结果获得了bpsl3319目的基因,构建了重组表达质粒pEspA-bpsl3319;实现了EspA-FilC的高效表达,其表达量约占菌体总蛋白的25%,纯化后蛋白纯度超过85%。Westernblot结果显示EspA-FliC能分别与抗类鼻疽杆菌多克隆抗体、抗EHEC O157∶H7 EspA的单抗和多抗血清发生特异性抗原抗体反应。EspA-FilC免疫Balb/c小鼠可刺激其产生高效价特异的IgG,且此抗体能识别EspA-FilC、EspA以及天然类鼻疽杆菌的FliC。结论重组表达了融合蛋白EspA-FilC,该蛋白具有较好的免疫反应性和良好的免疫原性。此研究为下一步研制类鼻疽杆菌和EHEC O157的二联疫苗奠定了基础。(本文来源于《免疫学杂志》期刊2013年03期）
王鹤,梁宏儒,胡旭,赵达,姜东君[10]（2013）在《无乳链球菌GapC蛋白和鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白的融合表达及纯化》一文中研究指出目的构建无乳链球菌(Streptococcus agalactiae,S.agalactiae)gapC基因和鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimu-rium,S.typhimurium)fliC基因的融合基因gapC-fliC,并在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法应用PCR技术分别扩增鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白fliC基因和无乳链球菌gapC基因片段,通过柔性肽(Gly4Ser)2编码序列将二者串联并克隆至质粒pQE-30上,构建重组原核表达质粒fliC-gapC-pQE30,转化E.coli XL1-Blue,IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE分析。表达产物经镍离子亲和层析柱纯化后,进行Western blot分析及融合蛋白活性检测。结果重组表达质粒fliC-gapC-pQE-30经双酶切和测序证明构建正确;表达的融合蛋白FliC-GapC相对分子质量约95 000,表达量占菌体总蛋白的58%,主要以包涵体形式存在,且可与小鼠抗鼠伤寒沙门菌和抗无乳链球菌多抗血清发生特异性反应,具有较好的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)活性。结论成功构建了重组表达质粒fliC-gapC-pQE-30,并在E.coli XL1-Blue中表达了融合蛋白,为下一步动物免疫保护性试验的研究奠定了基础。(本文来源于《中国生物制品学杂志》期刊2013年02期）
融合鞭毛论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的:评价I型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus 1,HSV-1)间层蛋白VP22能否增强铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)外膜蛋白F(the outer membrane protein F,OprF)及B型鞭毛蛋白(type B flagellins,FlaB)的体液、细胞免疫效力和感染保护作用。方法:1.动物免疫:(1)提取DNA疫苗pVAX1-VP22、pVAX1-OprF、pVAX1-OprF-VP22、pVAX1-FlaB、pVAX1-FlaB-VP22;(2)用体内转染试剂介导将疫苗肌肉注射BALB/c小鼠,免疫叁次后制备小鼠抗血清,分离脾脏T淋巴细胞。2.体液免疫:间接ELISA检测IgG1与IgG2a抗血清效价的比值。3.细胞免疫:(1)CCK-8检测T淋巴细胞的增殖活性;(2)ELISPOT检测细胞因子IFN-γ和IL-4分泌水平。4.感染保护实验:(1)腹腔注射PA于FlaB/VP22疫苗免疫后的BALB/c小鼠,构建铜绿假单胞菌肺部感染模型,一周后分离肺组织;(2)肺组织匀浆活菌计数评价肺部PA感染程度;(3)HE染色观察肺组织病变情况。结果:1.体液免疫:间接ELISA结果显示,pVAX1-OprF-VP22、pVAX1-OprF、pVAX1-FlaB-VP22和pVAX1-FlaB组小鼠血清均产生了特异性IgG1、IgG2a抗体,而pVAX1-VP22组和PBS组则为阴性。pVAX1-OprF-VP22组抗血清效价IgG2a/IgG1的比值显着高于pVAX1-Opr F组(P<0.05),pVAX1-FlaB-VP22组抗血清效价IgG2a/IgG1的比值显着高于pVAX1-FlaB组(P<0.05),Th细胞免疫应答分型倾向于Th1型。2.细胞免疫:(1)CCK-8检测T淋巴细胞的增殖活性,pvax1-oprf-vp22组刺激指数(si)显着高于pvax1-oprf组(p<0.05),pvax1-oprf组显着高于pvax1-vp22组和阴性对照(pbs)组,pvax1-vp22组与阴性对照(pbs)组之间无显着差异(p>0.05);pvax1-flab-vp22组刺激指数(si)显着高于pvax1-flab组(p<0.05),pvax1-flab组显着高于pvax1-vp22组与阴性对照(pbs)组,pvax1-vp22组与阴性对照(pbs)组之间无显着差异(p>0.05)。(2)elispot检测可分泌ifn-γ和il-4的t淋巴细胞数目,pvax1-oprf-vp22组分泌ifn-γ的t细胞显着高于pvax1-oprf组,pvax1-oprf组显着高于pvax1-vp22组和阴性对照(pbs)组,pvax1-vp22组与阴性对照(pbs)组之间无显着差异(p>0.05);pvax1-flab-vp22组分泌ifn-γ的t细胞数显着高于pvax1-flab组(p<0.05),pvax1-flab组显着高于pvax1-vp22组与阴性对照(pbs)组,pvax1-vp22组与阴性对照(pbs)组之间无显着差异(p>0.05)。所有免疫组分泌il-4的t细胞数都很低。3.感染保护实验:(1)肺组织匀浆活菌计数结果显示,pvax1-flab-vp22组显着低于pvax1-flab组(p<0.05),pvax1-flab组显着低于pvax1-vp22组与阴性对照(pbs)组,pvax1-vp22组与阴性对照(pbs)组之间无显着差异(p>0.05)。(2)肺组织病理he染色切片显微镜下可观察到,pvax1-vp22组和pbs对照组肺组织感染严重,肺泡结构消失,间质增生,支气管腔内大量组织坏死。pvax1-flab组肺泡结构较完整,支气管腔和间质内有中性粒细胞、浆细胞等大量炎症细胞浸润。pvax1-flab-vp22组可见部分红细胞产生,有充血现象。结论:1.vp22可显着增强单表达抗原oprf与flab的在小鼠体内诱导特异性体液和细胞免疫反应的效力,且更倾向于细胞免疫(th1型)。2.腹腔注射可成功建立铜绿假单胞菌肺部感染模型,VP22与FlaB融合表达的DNA疫苗可在一定程度上预防PA感染。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
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