长非编码RNA Gtl2在小鼠早期胚胎中调控转录因子Oct4的分子机制

论文摘要

Gtl2基因位于小鼠12号染色体末端的Dlk1-Dio3印记区间,其转录的长非编码RNA Gtl2对胚胎发育和肿瘤发生都具有重要功能。本实验室前期对小鼠早期胚胎的研究发现,Gtl2于桑葚胚期开始表达,并最终特异性定位于囊胚内细胞团（ICM）。功能研究表明,干扰Gtl2的表达虽然不影响囊胚发育率,但会影响囊胚的孵化（hatching）、体外生长（outgrowth）和内细胞团（ICM）的形成。进一步研究发现,Gtl2的表达下调导致囊胚ICM特异性转录因子Oct4的表达下降,提示Gtl2很可能通过影响Oct4而发挥作用。前期实验已经证实,Gtl2可能作为ceRNA（competing endogenous RNA）通过miRNA途径调控Oct4的表达,从而在早期胚胎中发挥作用。因此,本课题旨在筛选可能与Gtl2结合并调控Oct4的候选miRNA,并揭示Gtl2在小鼠早期胚胎中调控Oct4可能的分子机制。首先,利用生物信息学网站工具并结合已发表的论文,我们筛选出既能与Gtl2有潜在结合能力又被实验证实可以下调Oct4的候选miRNAs:let-7c（2个结合位点）、miR-24、miR-29a、miR-31和miR-135b。进而通过双荧光素酶报告系统证实,let-7c的两个结合位点都与Gtl2具有显著的结合能力,而miR-24、miR-29a和miR-135b也能与Gtl2发生结合,只有miR-31未检测到与Gtl2的结合。因此,我们将let-7c、miR-24、miR-29a、和miR-135b作为候选miRNA进行下一步研究。在细胞水平,我们利用Gtl2高表达的MLTC-1细胞（小鼠睾丸间质细胞瘤细胞）验证候选miRNAs与内源Gtl2的相互作用,结果表明只有let-7c与内源Gtl2存在明显的结合。我们又利用另一种表达Gtl2的N2a细胞（小鼠神经母细胞瘤细胞）,进一步证实let-7c与内源性Gtl2存在相互作用。因此,我们将let-7c作为最终候选miRNA,在胚胎水平进行进一步验证。在胚胎水平,我们通过挽救实验（rescue）证实,Gtl2能够挽救let-7c过表达所导致的囊胚体外生长过程中的ICM缺失,提高Oct4的表达水平,从而恢复胚胎的发育能力。说明Gtl2可以在早期胚胎内与let-7c发生相互作用,通过let-7c影响Oct4的表达,进而在早期胚胎中调控ICM的形成。综上所述,本课题筛选得到了与Gtl2结合并调控Oct4表达的候选miRNAs,并在细胞水平证实let-7c与内源Gtl2具有结合能力,进而在胚胎水平初步阐明了let-7c介导Gtl2调控Oct4的分子机制。此论文的研究成果,为深入理解Gtl2对早期胚胎发育及ICM的形成和分化机制奠定基础,为胚胎干细胞（ESC）和诱导多能干细胞（iPSC）等相关研究提供理论依据和参考。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
•   1.1 长非编码RNA
•     1.1.1 长非编码RNA分类
•     1.1.2 LncRNA的作用
•     1.1.3 LncRNA与早期胚胎
•   1.2 长非编码RNA Gtl2 的研究进展
•     1.2.1 Dlk1-Dio3 印记区间
•     1.2.2 Gtl2（Meg3）在肿瘤中的相关研究
•     1.2.3 Gtl2 在着床后胚胎中的相关研究
•   1.3 研究意义和主要研究内容
•     1.3.1 本课题的研究意义
•     1.3.2 本课题的主要研究内容
•     1.3.3 技术路线
• 第2章 实验材料和方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 实验动物、菌株、细胞系及载体
•     2.1.2 实验试剂、试剂盒
•     2.1.3 实验仪器、常用网站、软件、引物、测序
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 重组载体的构建
•     2.2.2 突变载体的构建
•     2.2.3 细胞的培养和转染
•     2.2.4 双荧光素酶报告系统实验
•     2.2.5 细胞总RNA的提取
•     2.2.6 RNA的反转录和定量PCR
•     2.2.7 体外转录
•     2.2.8 用于显微注射的受精卵的获取
•     2.2.9 显微注射和胚胎的体外培养
•     2.2.11 胚胎的体外生长（outgrowth）实验
• 第3章 筛选结合Gtl2 并靶向调控Oct4的miRNA
•   3.1 引言
•   3.2 生物信息学预测与Gtl2 结合并靶向调控Oct4的miRNA
•   3.3 构建双荧光素酶报告系统的pMIR-report重组载体
•   3.4 构建双荧光素酶报告系统的pMIR-report突变载体
•   3.5 构建双荧光素酶报告系统鉴定miRNA与 Gtl2 发生相互作用
•   3.6 讨论
•   3.7 本章小结
• 第四章 Gtl2 在细胞水平与候选miRNA相互作用研究
•   4.1 引言
•   4.2 MLTC-1 细胞中验证miRNA与内源性Gtl2 的相互作用
•   4.3 N2a细胞中验证let-7c与内源性Gtl2 的相互作用
•   4.4 讨论
•   4.5 本章小结
• 第五章 Gtl2 在胚胎水平中通过候选miRNA途径发挥作用研究
•   5.1 引言
•   5.2 Gtl2 转录本的扩增
•   5.3 .胚胎中挽救实验验证miRNA与 Gtl2 发生相互作用
•   5.4 讨论
•   5.5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录一
• 附录二
• 附录三
• 附录四
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张喜美佳

导师: 韩正滨

关键词: 长非编码,早期胚胎发育

来源: 哈尔滨工业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 哈尔滨工业大学

分类号: Q132

DOI: 10.27061/d.cnki.ghgdu.2019.003591

总页数: 71

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