猪圆环病毒2型Cap蛋白在CHO-K1细胞系中的真核表达及鉴定

论文摘要

猪圆环病毒2型（PCV2）流行于世界各国猪群中,主要与断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪呼吸道疾病综合征（PRDC）、猪皮炎与肾病综合征（PDNS）、仔猪先天性震颤（CT）以及猪繁殖系统障碍等多种疾病密切相关,这些疾病被统称为猪圆环病毒相关疾病（PCVD）,严重影响着世界养猪业的健康发展。目前,已知的猪圆环病毒包括三种,猪圆环病毒1型（PCV1）、2型（PCV2）和3型（PCV3）。其中,PCV2核衣壳蛋白Cap含有抗原中和表位,可产生针对PCV2的特异性抗体,是PCV2亚单位疫苗和血清诊断的主要目标蛋白,被大量应用于实际生产中。PCV2的抗体检测方法主要有ELISA、IPMA和IFA等,其中ELISA抗体检测方法具备操作简便,可同时检测大量样品等优点,得到科研机构和养殖场的普遍应用。本研究基于CHO-K1真核表达系统,构建重组质粒pEE12.4-PCV2-Cap,转染CHO-K1细胞,通过加压筛选,有限稀释,得到能够高效表达Cap蛋白的单克隆细胞株,并对该细胞株进行悬浮驯化、发酵、纯化,得到目的蛋白通过Western blot以及动物免疫实验验证其免疫原性。结果表明PCV2-Cap蛋白能够在CHO-K1细胞中稳定表达;发酵过程中活细胞密度高达6.0×106个/mL,细胞活力在80%以上,PCV2-Cap蛋白表达量约为370 mg/L;并通过Western blot验证和间接ELISA检测方法的建立,证明了该蛋白具备良好的免疫原性。本研究成功构建了表达PCV2-Cap蛋白的CHO-K1悬浮稳转细胞系,并初步建立了间接ELISA检测方法,为猪圆环病毒2型血清学检测方法的建立奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
•   1.1 猪圆环病毒的发现
•   1.2 PCV的分类
•     1.2.1.1 型猪圆环病毒PCV
•     1.2.2.2 型猪圆环病毒PCV
•     1.2.3.3 型猪圆环病毒PCV
•   1.3 猪圆环病毒2型分子生物学特征
•   1.4 猪圆环病毒2型的免疫调节
•   1.5 PCV2的诊断方法
•     1.5.1 病毒的分离与鉴定
•     1.5.2 血清学检测
•     1.5.3 分子生物学诊断技术
•   1.6 PCV2疫苗研究现状
•   1.7 CHO真核表达体系
•   1.8 研究目的及意义
• 第二章 猪圆环病毒2型Cap蛋白真核表达
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 细胞与载体
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 主要溶液配制
•     2.1.4 试验仪器
•     2.1.5 引物设计及合成
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 pEE12.4-PCV2-Cap重组质粒的构建
•     2.2.2 无内毒素质粒提取和质粒线性化处理
•     2.2.3 pEE12.4-PCV2-Cap转染CHO-K1细胞
•     2.2.4 细胞株悬浮培养及摇瓶发酵
•     2.2.5 蛋白纯化与动物免疫
•     2.2.6 间接ELISA检测方法的建立
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 重组质粒pEE12.4-PCV2-Cap的构建
•     2.3.2 确定嘌呤霉素筛选浓度
•     2.3.3 CHO-K1 细胞瞬转检测
•     2.3.4 单克隆细胞株Western blot检测
•     2.3.5 发酵过程中活细胞密度以及活力检测
•     2.3.6 PCV2-Cap单克隆细胞株蛋白表达检测
•     2.3.7 蛋白纯化
•     2.3.8 蛋白免疫原性分析
•     2.3.9 最佳抗原包被浓度以及血清稀释度的确定
•   2.4 讨论
• 参考文献
• 个人简历、在学期间发表的学术论文及研究成果
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 武乐祎

导师: 王选年

关键词: 猪圆环病毒,蛋白,真核表达,细胞

来源: 郑州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 郑州大学

分类号: S852.651

总页数: 53

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