导读:本文包含了免疫纳米粒论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:IgA酶,IgA酶纳米粒,靶向治疗,免疫复合物
免疫纳米粒论文文献综述
朱梦莲[1]（2019）在《IgA酶纳米粒靶向降解肾脏系膜区免疫复合物的体内研究》一文中研究指出目的:IgA肾病(IgA nephropathy,IgAN)是常见的原发性肾小球肾炎疾病,但目前缺乏有效治疗方法。异常糖基化IgA1(Gd-IgA1)及其免疫复合物在肾小球的沉积是IgAN发病机制的关键环节,以清除低糖基化IgA1及其免疫复合物为治疗靶点的药物成为IgAN治疗的潜在手段。我们的前期研究显示,病原菌来源的IgA酶可以通过特异性切割IgA1,在体内外降解异常糖基化IgA1及其免疫复合物,然而因其缺乏靶向性及存在的免疫原性和潜在毒副作用降低了临床应用价值。因此,本研究根据前期研究结果,选择酶活性更佳的流感嗜血杆菌(ATCC 49247)来源的基因工程IgA酶进行纳米粒工艺包装,研究纳米粒包装能否提高IgA酶递送至肾小球系膜区的靶向性和对IgA1免疫复合物的降解作用以及纳米粒包装后的IgA酶能否具备更低的生理毒副作用。方法:1.高活性重组IgA酶的制备。从流感嗜血杆菌(ATCC 49247)中克隆IgA酶基因全长,构建His6-IgA酶原核融合表达载体,在大肠杆菌E.coli(BL21)中进行原核表达,采用镍柱亲和层析法和离子交换色谱法大量制备高纯度的具有生物活性的IgA酶,纯化后的IgA酶经SDS-PAGE电泳后银染法和Elisa法检测酶对IgA1的分解活性,BCA法测定蛋白浓度;2.纳米粒的制备及其对肾脏靶向性的确定。利用纳米粒包装工艺制备直径为60-120 nm的纳米粒,制备带正电荷,能对呈明显负电荷的肾小球系膜区和基底膜有静电亲和力的纳米粒(nanoparticles),同时将制备的带负电荷不亲和肾小球系膜区的纳米粒(ddab nanoparticles)设为对照,制备过程中对白蛋白(纳米粒制备原料)进行罗丹明(rhodamine-DHPE)荧光物质标记。将雄性BALB/c小鼠每组3只随机分配,分别设为PBS组(negative control),带正电荷的纳米组(nanoparticles)和带负电荷的纳米粒组(ddab nanoparticles),分别将PBS或两种纳米粒经尾静脉注射至BALB/c小鼠体内,不同时间点(5min/15min/30min)处死老鼠,取心、肝、脾、肺、肾组织,冰冻切片观察肾脏和其他组织的荧光分布,确定肾脏靶向性最优直径的纳米粒。3.IgA酶纳米粒的制备及其在小鼠体内肾系膜靶向性的确定。在确定最优靶向直径的纳米粒后,制备IgA酶纳米粒,并通过SDS-PAGE电泳后银染法检测IgA酶纳米粒的生物活性。将正常雄性BALB/c小鼠随机分为IgA酶纳米粒组(nanoparticles)、纳米粒组(blank nanoparticles)和PBS对照组(negative control),每组3只。每组分别向小鼠尾静脉中注射肾脏靶向最优直径(~120 nm)的荧光标记的IgA酶纳米粒、纳米粒或PBS,5min后处死小鼠,检测IgA酶纳米粒在小鼠体内各器官(心、肝、脾、肺、肾组织)的分布,观察IgA酶纳米粒在肾小球系膜区和其他组织的定位,并通过小动物活体成像技术观察纳米粒的肾脏靶向性。通过该部分的研究确定IgA酶纳米粒能够靶向性到达肾脏。4.IgA酶纳米粒对passive IgAN模型小鼠体内沉积IgA1免疫复合物降解作用的研究。通过尾静脉注射人源低糖基化处理的IgA1-IgG免疫复合物到BALB/c小鼠体内,构建以系膜免疫复合物沉积为特征的小鼠passive IgAN模型。将雄性BALB/c小鼠随机分为4组,每组3只,分别为PBS对照组(PBS),模型组(IgA1-IgAG),IgA酶治疗组(IgA protease)和IgA酶纳米粒治疗组(IgA protease-NPs)。在注射免疫复合物12 h后,治疗组给予尾静脉注射靶向性最优直径(~120 nm)的IgA酶纳米粒或常规IgA酶,2 h后分别处死小鼠,取新鲜肾脏组织做冰冻切片,免疫荧光比较观察IgA1-IgG免疫复合物清除情况。5.IgA酶纳米粒生理毒性的分析。将雄性BALB/c小鼠随机分为4组,每组3只,分别为PBS对照组(negative control),模型组(model),IgA酶治疗组(IgA protease)和IgA酶纳米粒治疗组(nanoparticles)。在造模12 h后,治疗组给予尾静脉注射靶向性最优直径的IgA酶纳米粒或常规IgA酶,于2 h、7 days和30 days后分别处死小鼠,采血做生化检测,并测定肝、肾功能(ALT、AST和CREA、BUN),另外取心、肝、脾、肺和肾组织进行苏木素-伊红染色(HE染色),观察各组织的形态结构。结果:1.银染结果提示IgA酶的成功纯化,经纳米粒包装后的IgA酶有良好的生物活性,并且与常规IgA酶的生物活性无差异;2.原位组织荧光结果显示直径约为120 nm的纳米粒和IgA酶纳米粒都能靶向性到达肾脏系膜区,小动物活体成像结果表明尾静脉注射荧光标记的纳米粒至小鼠体内5 min后,纳米粒较对照组表现出明显的肾脏积聚性,差异具有统计学意义(P<0.05);3.免疫荧光结果显示在肾脏系膜区有大量免疫复合物沉积,验证小鼠passive IgAN模型的成功构建。与模型组相比,IgA酶纳米粒和常规IgA酶治疗组小鼠肾脏系膜区的免疫复合物显着减少;同时与常规IgA酶治疗组相比,IgA酶纳米粒组小鼠肾脏系膜区的免疫复合物明显更少,甚至有些复合物已被完全清除。4.HE染色结果显示IgA酶纳米粒组和IgA酶组小鼠的心、肝、脾、肺、肾各组织结构皆无病理改变,与正常PBS对照组相比无差异;生化检测结果亦提示各组肝肾功能正常。结论:与常规IgA酶相比,IgA酶纳米粒有更好的肾系膜靶向性,其清除和降解肾脏系膜区免疫复合物的效果比常规IgA酶更佳且无明显毒副作用。(本文来源于《西南医科大学》期刊2019-06-01）
张妮[2]（2019）在《载aPD1靶向相变型纳米粒对恶性黑色素瘤光热治疗及增效免疫治疗的研究》一文中研究指出第一部分载aPD1靶向相变型纳米粒的制备及性能检测目的制备一种载程序性死亡受体1抗体(aPD1)、全氟戊烷(perfluoropentane,PFP)和四氧化叁铁(Fe3O4)的靶向纳米粒(GOP@aPD1),检测其粒径电位、稳定性、光热性能、相变特性、药物含量及药物释放等性能。方法首先制备粘附多肽(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser,GRGDS)靶向的聚乳酸羟基乙酸/聚乙二醇高分子材料(PLGA-PEG-GRGDS),并鉴定其化学结构。采用改良的叁步超声乳化法制备GOP@aPD1纳米粒(nanoparticles,NPs)。检测该纳米粒基本的理化性质,包括粒径、电位、形态结构、吸收光谱、傅里叶红外吸收峰及X射线光电子能谱分析吸收峰。于制备后不同时间点(0.5h,1d,3d,7d)测量纳米粒在PBS及含胎牛血清PBS溶液中粒径变化。流式细胞术检测纳米粒与GRGDS抗体连接情况。光镜下观察不同温度下(室温、37℃和45℃)纳米粒的相变情况。在660nm激光辐照下,检测不同浓度条件下该纳米粒的光热特性。观察660nm激光辐照后纳米粒不同时间点(2min,6min,10min,12min)超声增强信号。用酶联免疫吸附(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)测定检测GOP@aPD纳米粒内的aPD1药物含量,以及激光辐照触发aPD1药物释放情况。激光共聚焦观察GOP@aPD纳米粒对aPD1载药及释药情况。结果通过氢谱核磁分析对聚合物PLGA-PEG-GRGDS进行了结构确认。用超声乳化法制备的GOP@aPD1纳米乳呈棕褐色,扫描电镜(scanning electron microscopy,SEM)观察到该纳米粒呈球形结构,大小均一,分散度好。透射电镜(transmission electron microscope,TEM)显示点状Fe3O4颗粒均匀分布在该纳米粒内。马尔文粒径仪测得GOP@aPD1 NPs平均粒径218nm,平均电位为-5mV。在PBS及含10%胎牛血清PBS溶液4℃放置7天,GOP@aPD1 NPs粒径无明显改变,证明该纳米粒稳定性良好。流式细胞术测得对比非靶向纳米粒,GOP@aPD1 NPs与GRGDS抗体连接率更高,证明纳米粒表面修饰了GRGDS多肽。原子吸收光谱法测得GOP@aPD1 NPs中Fe3O4的包封率为63%。光学显微镜观察到,在室温及37℃条件下纳米粒基本保持稳定。但是在45℃纳米粒发生液气相变,体积增大,相互融合并破裂。说明GOP@aPD1 NPs相变温度约45℃。光声仪吸收光谱显示GOP@aPD1 NPs在700nm左右有强吸收峰。根据PLGA-PEG-GRGDS浓度,将GOP@aPD1 NPs稀释为1.25-10mg/mL。在660nm激光辐照下,不同浓度GOP@aPD1 NPs均有升温效果,且升高温度与纳米粒浓度正相关,其中5mg/mL组可升温达45℃左右。在660nm激光连续辐照下,纳米粒超声增强信号随时间呈逐渐上升-下降趋势,辐照10min纳米粒超声增强信号最大,说明其液气相变随激光辐照时间逐渐增强10min达高峰。ELISA测的GOP@aPD1 NPs中aPD1药物的载药量为1.56%(w/w),包封率为98.9%。体外药物释放试验显示,GOP@aPD1 NPs内的aPD1药物在激光辐照下2h内快速释放,6h后药物释放趋平缓。激光共聚焦显微镜观察到,在激光辐照前DiI标记GOP@aPD1 NPs的红色荧光与FITC标记aPD1的绿色荧光共定位呈黄色荧光信号,而在激光辐照后红色荧光与绿色荧光两者分离,说明激光辐照产生的光热效应促使GOP@aPD1 NPs释放其内负载的aPD1药物。结论本实验通过乳化法制备了GOP@aPD1纳米粒,形态规则,大小较均匀,性质稳定,负载aPD1及Fe3O4,具有较好的光热能力及液气相变的能力,能够在660nm激光辐照作用下释放aPD1药物。第二部分载aPD1靶向相变型纳米粒对黑色素瘤靶向性及体内分布研究目的观察GOP@aPD1 NPs在体外、体内对黑色素瘤细胞B16F10靶向性,以及该纳米粒的在体内的生物分布、血液中循环时间及体内生物安全性。方法首先制备GOP@aPD1 NPs与非靶向NPs。在体外实验中,激光共聚焦显微镜分别观察Di I标记的两组纳米粒与DAPI染色的B16F10细胞共定位情况,流式细胞术分别测量Di I标记的两组纳米粒与B16F10细胞孵育不同时间后连接率。CCK8法观察不同浓度(2.5mg/ml,5mg/ml,10mg/ml,15mg/ml)GOP@aPD1 NPs与B16F10细胞孵育后细胞活性变化。在体内实验中,首先建立C57B6鼠B16F10-luc黑色素瘤模型,当肿瘤体积大约长至约100mm3时,经C57B6鼠尾静脉分别注射Di R标记GOP@aPD1 NPs与非靶向NPs。在Xenogen IVIS生物发光成像系统中采集荧光图像,分析肿瘤及重要器官的信号强度。C57B6鼠尾静脉分别注射不同浓度(5mg/ml,10mg/ml)GOP@aPD1 NPs,14天后取小鼠血清分析CK、LDH-L、AST、ALT、BUN及CR水平,观察GOP@aPD1 NPs在体内生物安全性。用PerCP/Cy5.5标记的aPD1制备GOP@aPD1 NPs。经荷瘤C57B6鼠尾静脉分别注射PerCP/Cy5.5标记的GOP@aPD1 NPs及PerCP/Cy5.5标记的游离aPD1药物。注射后不同时间点(6h,10h)取肿瘤及重要器官,制备冰冻切片,在激光共聚焦显微镜下观察各组织切片中PerCP/Cy 5.5红色荧光信号,Image-Pro Plus 6.0软件分析信号强度。小鼠尾静脉注射PerCP/Cy5.5标记的GOP@aPD1 NPs后不同时间点(0.5h,1h,2h,4h,6h,8h,12h,24h)采集小鼠血液,进行荧光分光光度计分析。结果激光共聚焦显微镜观察到Di I标记GOP@aPD1 NPs的红色荧光,较Di I标记非靶向NPs的红色荧光更多的定位在B16F10细胞周围。GOP@aPD1 NPs及非靶向NPs与B16F10细胞孵育后2h及10h后,流式细胞术测得GOP@aPD1 NPs与细胞连接率显着高于非靶向NPs(p<0.01)。不同浓度GOP@aPD1 NPs(2.5mg/ml,5mg/ml,10mg/ml,15mg/ml)与B16F10细胞孵育后细胞活性无显着变化。但B16F10细胞与GOP@aPD1 NPs孵育后再接受激光辐照后细胞活性显着降低,且细胞活性随GOP@aPD1 NPs浓度升高而降低。在体内靶向性实验中,GOP@aPD1 NPs通过高通透性和滞留(enhanced permeability and retention,EPR)效应及主动靶向性在肿瘤部位逐渐富集,小动物活体荧光观察到肿瘤部位荧光信号随时间推移而逐渐增强,在给药6h后达到最高峰、24h后减弱。在非靶向NPs组,小鼠肿瘤部位各时间点荧光信号均显着低于GOP@aPD1 NPs组。在C57B6鼠尾静脉分别注射不同浓度GOP@aPD1 NPs(5mg/ml,10mg/ml)14天后,血清CK、LDH-L、AST、ALT、BUN及CR变化无统计学差异。经荷瘤鼠尾静脉分别注射PerCP/Cy5.5标记的GOP@aPD1 NPs 6h及24h后,通过激光共聚焦显微镜均可观察到肿瘤组织中GOP@aPD1NPs红色荧光信号。但在PerCP/Cy5.5标记的aPD1游离药物组,通过激光共聚焦显微镜几乎不能观察到肿瘤组织中红色荧光信号。肿瘤组织中荧光信号强度分析显示,在6h及24h时间点GOP@aPD1 NPs组肿瘤组织中aPD1荧光强度均显着高于aPD1游离药物组。荷瘤鼠尾静脉注射PerCP/Cy5.5标记的GOP@aPD1 NPs 24h后,仍可通过荧光分光光度计检测血液中荧光信号。GOP@aPD1 NPs在体内循环的半衰期约4.39h。结论制备的GOP@aPD1 NPs可通过EPR效应及主动靶向性在肿瘤组织中富集,实现靶向黑色素瘤递送aPD1药物,并具有较长的体内循环时间及良好的生物安全性,为下一步体内治疗实验奠定了基础。第叁部分光热介导载aPD1靶向相变型纳米粒治疗恶性黑色瘤及增效免疫治疗机制研究目的研究光热(Photothermal therapy,PTT)介导GOP@aPD1NPs治疗黑色素瘤的效果,及其增效aPD1免疫治疗的相关机制。方法为了观察光热介导GOP@aPD1 NPs在体内光热效应,建立C57B6鼠B16F10-luc黑色素瘤模型,当肿瘤体积约80mm3时开始给予不同处理。把荷瘤小鼠随机分成3组,对照组(不处理),PTT组及GOP@aPD1+PTT组。其中GOP@aPD1+PTT组先经小鼠尾静脉注射GOP@aPD1 NPs(~200μL,5mg/m L),6h后给予肿瘤部位660nm激光辐照(0.1W/cm2,10min)。PTT组仅给予660nm激光辐照(0.1W/cm2,10min)肿瘤组织。用红外热成像仪观察肿瘤部位的升温情况。小鼠经处理后不同时间点(24h,72h,168h)取血清,通过ELISA分析炎症因子IL-6、TNF-α及IFN-γ变化水平。为了观察光热介导GOP@aPD1 NPs在体内对恶性黑色素瘤治疗作用,首先制备GOP@aPD1 NPs,单载Fe3O4 NPs及单载aPD1 NPs。其中单载Fe3O4 NPs不含aPD1,单载aPD1 NPs不含Fe3O4。建立C57B6鼠B16F10-luc黑色素瘤模型,当肿瘤体积大约80 mm3时开始于不同处理。把小鼠随机分成8组,1.对照组(生理盐水),2.游离aPD1组,3.PTT组,4.游离aPD1+PTT组,5.单载Fe3O4 NPs+PTT组,6.单载aPD1NPs+PTT组,7.GOP@aPD1组,8.GOP@aPD1+PTT组。其中2及7组仅分别静脉注射游离aPD1及GOP@aPD1 NPs;3组仅给予肿瘤部位660 nm激光辐照(0.1W/cm2,10min);4、5、6及8组分别先经小鼠尾静脉注射游离aPD1、单载Fe3O4 NPs、单载aPD1 NPs及GOP@aPD1NPs,6h后给予肿瘤部位660nm激光辐照(0.1W/cm2,10min)。经过不同的处理后,观察小鼠的肿瘤体积大小、体重和生存期。在处理后不同时间点(0d、7d、14d)小鼠腹腔注射luc荧光素底物,Xenogen IVIS生物发光成像系统中采集肿瘤荧光信号。在处理7d后,每组随机处死小鼠,收集心、肝、脾、肺、肾和肿瘤组织进行苏木精伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色,并对肿瘤组织进行TUNEL免疫荧光染色检测肿瘤细胞的增殖和凋亡。为研究光热介导GOP@aPD1 NPs增效aPD1免疫治疗的机制。实验中小鼠分组及处理同上。在处理7d后处死小鼠,收集肿瘤组织进行流式细胞术及免疫荧光染色检测肿瘤浸润T淋巴细胞数量,CD8+T淋巴细胞及CD4+T淋巴细胞亚群的比例。结果体内光热反应实验发现,PTT组及GOP@aPD1+PTT组给予激光辐照后,肿瘤部位的最高温度分别达到约42℃和45℃,均可产生光热效果。但ELISA分析血清炎症因子IL-6、TNF-α及IFN-γ结果显示,GOP@aPD1+PTT组动物血清炎症因子水平显着高于PTT组。在处理后72h,GOP@aPD1+PTT组血清IFN-γ水平是PTT组3.5倍;在处理后168h后,GOP@aPD1+PTT组血清IFN-γ水平是PTT组3倍。这部分结果证明了光热介导GOP@aPD1 NPs治疗可产生肿瘤光热治疗效应,并有效地激活体内炎症反应水平。在体内黑色素瘤治疗观察中,游离aPD1组、PTT组、单载Fe3O4NPs+PTT组及GOP@aPD1组肿瘤生长未受到明显的抑制作用,和对照组的肿瘤生长无明显差异。在游离aPD1+PTT组及单载aPD1NPs+PTT组中,肿瘤生长受到了一定程度的抑制。然而GOP@aPD1+PTT组肿瘤生长受到了几乎完全抑制。活体荧光实验显示,在治疗14天时GOP@aPD1+PTT组肿瘤荧光强度最弱。GOP@aPD1+PTT组动物生存期均超过35天,而游离aPD1+PTT组及单载aPD1 NPs+PTT组动物平均生存期分别为19天及20天。肿瘤组织HE染色发现,GOP@aPD1+PTT组肿瘤组织可见大量肿瘤细胞坏死,无完整细胞结构,镜下呈红染无结构区,且TUNEL免疫荧光染色结果显示该组肿瘤组织的凋亡荧光最高。各组主要器官的HE染色均未见明显异常,证明了该治疗方式的生物安全性。激光共聚焦显微镜发现对照组肿瘤组织切片中几乎没有肿瘤浸润T淋巴浸润,而GOP@aPD1+PTT组肿瘤组织切片中可见大量CD3+T淋巴细胞,CD8+T淋巴细胞及CD4+T淋巴细胞浸润。流式细胞术分析肿瘤微环境中浸润T淋巴细胞数量及亚群结果显示,GOP@aPD1+PTT组肿瘤浸润CD3+T淋巴细胞数量在各组中最高,且CD8+T淋巴细胞比例也在各组中最高。证明了光热介导的GOP@aPD1NPs治疗有效提高了肿瘤组织微环境中抗肿瘤效应T细胞量,从而增效aPD1免疫治疗疗效。结论光热介导的GOP@aPD1 NPs治疗,提高了体内抗肿瘤炎症反应水平,增加了肿瘤微环境T淋巴细胞量,实现免疫“冷”肿瘤向免疫“热”肿瘤转变,从而增强aPD1的免疫治疗效果,有效地抑制恶性黑色素瘤生长,为恶性黑色素治疗提供一种新途径。(本文来源于《重庆医科大学》期刊2019-05-01）
王若平[3]（2019）在《硫化铜纳米粒介导的肿瘤热疗联合免疫治疗》一文中研究指出纳米材料介导的的肿瘤光热治疗(PTT)引起了研究者的广泛关注。它消融肿瘤的基本原理是聚集在肿瘤部位的光热纳米材料,通过将吸收的近红外光转换为高于45℃的高温,从而导致肿瘤组织的破坏,使其发生死亡,凋亡。这种治疗方式可以降低常规治疗方案引起的不良反应并具备癌症治疗微创性的优点,成为具有广泛前景的肿瘤治疗手段。然而单一的光热治疗难以有效地控制肿瘤的转移和复发。针对此问题,本文设计了表面功能化修饰的硫化铜纳米粒子(CuS NPs),肿瘤组织在接受高温消融的过程中,会伴随着肿瘤相关抗原的释放,这些肿瘤相关抗原被功能化的硫化铜纳米粒所吸附,将其转移至周边肿瘤引流淋巴结,使得机体的免疫系统可以对肿瘤相关抗原进行重新识别和致敏,引起机体的免疫响应,同时联合免疫检查点抑制剂anti-PD-L1,达到协同增效治愈肿瘤的目的。本课题采用小鼠乳腺癌4T1肿瘤模型,选用具有较强抗原吸附能力的马来酰亚胺聚乙二醇修饰的硫化铜纳米粒(CuS NPs-PEG-Mal),联合免疫检查点抑制剂(anti-PD-L1),来评价小鼠4T1乳腺癌的治疗效果。结果显示基于CuS NPs-PEG-Mal的热疗明显增加了血清中炎性细胞因子的水平,增强了肿瘤浸润性CD8~+T细胞、CD3~+CD45~+T细胞数量,抑制了小鼠4T1肿瘤模型中原位肿瘤和远端肿瘤的生长。这种联合增效的治疗策略可为转移和复发性肿瘤的治疗提供新思路。(本文来源于《河北大学》期刊2019-05-01）
施米丽,郭美仙,金家瑞,刘光明,沈磊[4]（2019）在《美洲大蠊提取物CⅡ-3纳米粒对免疫力低下小鼠的免疫调节作用》一文中研究指出研究美洲大蠊(俗称蟑螂)提取物CⅡ-3纳米粒对免疫力低下小鼠免疫功能的改善作用。制备美洲大蠊提取物CⅡ-3纳米粒,并建立免疫功能低下小鼠模型,将小鼠随机分为正常对照组和模型组(灌胃生理盐水,0.2mL/10g),辅料组(灌胃空白纳米粒,40mg/kg,0.2mL/10g),阳性对照组(灌胃左旋咪唑,40mg/kg,0.2mL/10g),CⅡ-3组(灌胃美洲大蠊提取物CⅡ-3,40mg/kg,0.2mL/10g),CⅡ-3纳米粒5个剂量组(灌胃美洲大蠊提取物CⅡ-3纳米粒10、20、40、80、160mg/kg,0.2mL/10g),各组连续给药15d后,检测小鼠外周血白细胞、红细胞、血小板;脏器指数;巨噬细胞吞噬功能;血清中免疫球蛋白IgG、IgM的含量。研究结果显示,CⅡ-3纳米粒各剂量组均可以显着提高免疫低下小鼠的白细胞数量(P<0.05);能显着提高免疫力低下小鼠的肝脏、脾脏和胸腺指数(P<0.01);可显着提高其巨噬细胞吞噬能力(P<0.05)和免疫力低下小鼠血清中IgG、IgM的含量(P<0.01),说明CⅡ-3纳米粒有改善免疫力低下小鼠免疫功能的作用。(本文来源于《动物医学进展》期刊2019年02期）
范彩霞,徐新,陈志喜,肖旺钏,纪孝峰[5]（2018）在《人乳腺珠蛋白单克隆抗体修饰的免疫磁性纳米粒的制备和表征》一文中研究指出目的制备粒径均一、超顺磁性强、性质稳定、免疫活性强并可识别乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞的免疫磁性纳米粒(immunomagnetic nanoparticles,IMNP)。方法多元醇法合成含有活性羧基基团的超顺磁氧化铁纳米粒(superparamagnetic oxide iron nanoparticles containing reactive carboxyl groups,SMNP-COOH),热重分析法测定SMNP-COOH表面羧基含量,邻二氮菲测定铁含量。在1-甲基-3-乙基碳二亚胺(EDC),N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化下,采用碳二亚胺偶联法将鼠抗人乳腺珠蛋白(anti human mammaglobin,anti-hMAM)单克隆抗体共价修饰结合至SMNP-COOH表面合成IMNP。透射电镜(transmission electron microscope,TEM)、X射线衍射仪(X-ray powder diffraction XRD)、振动样品磁强计(vibrating sample magnetometer,VSM)、激光散射粒径电位测定仪和邻二氮菲法测定铁含量等方法分别对SMNP-COOH和IMNP进行表征,酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定IMNP表面抗体活力。结果 X-射线粉末衍射检测表明,SMNP-COOH和IMNP两者特征峰与标准Fe_3O_4的特征峰一致。SMNP-COOH和IMNP的铁含量分别0. 205和0. 164 mol·L~(-1);透射电镜检查提示,SMNPCOOH和IMNP均呈球形或椭球形,透射电镜测定粒径为(13. 7±3. 6)和(15. 4±4. 5) nm;流体粒径测定结果表明,SMNPCOOH和IMNP强均粒径和多分散系数分别为23. 4,71. 2 nm,0. 303和0. 175;磁学性能研究表明,SMNP-COOH和IMNP均具有超顺磁性,抗体结合可以降低SMNP-COOH的磁性,两者质量饱和磁化强度分别为71. 37和67. 68 emu·g-1Fe。ELISA法测定IMNP表面的抗体活力表明,IMNP表面结合的抗体量为93μg·mg-1IMNP。抗-h MAM抗体修饰的IMNP能与乳腺癌细胞株MDA-MB-415具有强的选择性和特异性。结论成功合成超顺磁性强,能与乳腺癌细胞株发生特异性结合的免疫磁性纳米粒,可用于免疫磁性分离富集乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTCs),从而为乳腺癌CTCs的特异性检测提供更有利的武器。(本文来源于《中国药学杂志》期刊2018年23期）
朱梦莲,李建春,王丽,张宇韦,王露[6]（2018）在《IgA酶纳米粒靶向降解肾脏系膜区免疫复合物的作用研究》一文中研究指出目的:对流感嗜血杆菌H. infuenzae 49247来源的基因工程Ig A酶进行纳米粒工艺包装,研究纳米粒包装能否提高IgA酶递送至肾小球系膜区的靶向性和对IgA免疫复合物的降解作用。方法:首先,从H. infuenzae 49247中提取制备大量高纯度的重组IgA酶,制备尺寸范围为60～120nm的纳米粒(罗丹明B标记),并尾静脉注射到随机分配的雄性BALB/c小鼠体内,(本文来源于《中国中西医结合学会肾脏疾病专业委员会2018年学术年会论文摘要汇编》期刊2018-10-11）
Khawar,Ali,Shahzad（哈瓦）[7]（2018）在《杀伤性PLGA纳米粒诱导小鼠同种皮肤免疫耐受的研究》一文中研究指出治疗移植排斥的理想方法是诱导抗原特异性免疫耐受,因为后者不会损害宿主的整体免疫功能,极大降低移植排斥治疗中感染等疾病的发生率。纳米技术的发展,极大促进了抗原特异性免疫耐受诱导技术的提高。已有研究者开发出可以靶向杀伤同种抗原特异性T、B淋巴细胞和抗原提呈细胞的纳米颗粒,并在诱导移植耐受中得到有效证实。纳米仿生颗粒在世界范围内被认为是自身免疫性疾病和同种异体移植排斥反应的有效免疫调节剂,但目前大多数纳米仿生颗粒的设计思路主要集中在包裹缓释可溶性抗原、毒素或细胞因子,并让细胞通过吞噬或胞饮作用吞噬纳米粒子进而诱导致耐受性抗原提呈细胞如调节性DC,再通过后者诱导抗原特异性T细胞凋亡或抑制,很少有研究关注仿生纳米颗粒与抗原特异性T细胞的直接接触。而且以往研究中,仿生纳米颗粒所负载的调节分子种类较少,多种免疫调节分子的联合递送很少见。研究目的:本研究制备聚乳酸-羟基乙酸纳米粒(PLGA-NPs)并在其表面共价偶联同种靶向抗原H-2K~b-Ig二聚体、负调节分子抗-Fas单抗、PD-L1-Fc和TGF-β以及抗吞噬分子CD47-Fc,研制可生物降解的、能直接靶向结合同种反应性T细胞的、多效能的杀伤性PLGA纳米粒,进而探索其在小鼠同种异体皮肤移植模型中治疗皮肤移植排斥的疗效,作用机制以及可能引发的毒副作用等。研究方法及结果:1、PLGA纳米粒的制备及表征:采用复乳溶剂挥发法制备了两种规格的PLGA纳米粒。扫描电子显微镜(SEM)观察纳米粒的形状和大小,激光粒度检测仪分析纳米粒的直径分布,Zeta电位仪检测其表面的zeta电位。结果显示,所制备的两种规格的PLGA纳米粒均呈规则圆形,表面光滑,其粒径分别为202.4nm和78.8 nm(分别称为200nm和80 nm粒子),平均Zeta电位分别为-3.09mv和-8.63mv。而后,通过改良的EDC/NHS化学法将聚乙烯亚胺(PEI)结合于纳米颗粒表面,使其表面功能化,布满-NH_2~+基团,从而能够共价偶联蛋白分子。2、杀伤性PLGA纳米粒的制备及表型分析:在PEI修饰的PLGA纳米粒表面偶联BSA,用Micro BCA微量蛋白定量试剂盒分析PLGA纳米粒表面的最大蛋白负载量。结果显示,1 mg的直径200 nm和80 nm粒子表面的最μμ大蛋白吸附量分别为75.31μg和77.51μg。以此为基础,在表面功能化的PLGA纳米粒表面联合吸附H-2K~b-Ig二聚体、抗-Fas单抗、PD-L1-Fc、TGF-β和CD47-Fc等5种免疫分子,制备多效能靶向杀伤性PLGA纳米粒。通过相应的荧光单抗染色和激光共聚焦显微镜观察显示,H-2K~b-Ig二聚体、抗-Fas单抗、PD-L1-Fc和CD47-Fc四种分子均成功吸附于PLGA纳米粒表面。因为没有相应的荧光标记的抗TGF-β单抗,所以TGF-β的表面负载没有检测。3、小鼠同种皮肤移植模型的建立和杀伤性PLGA纳米粒的体内治疗:7-8周龄的雄性C57BL/6小鼠(H-2K~b)作为皮肤供者,H-2K~b基因突变的C57BL/6小鼠(bm1鼠,H-2K~(bm1))作为皮肤受者,建立同种异体皮肤移植模型。在皮肤移植后第9、11和13天,将直径200 nm的杀伤性PLGA纳米粒经尾静脉输注治疗叁次,同时设立7种对照PLGA纳米粒治疗组。每天观察皮肤移植物存活状态,第15天时通过免疫荧光法检测受者皮肤移植物中同种反应T细胞、CD4~+和CD8~+T细胞的浸润程度。结果显示,杀伤性PLGA纳米粒能强有力地抑制移植排斥,延长皮肤移植物存活期达45天(MST 61天),其他对照组(PBS、Blank NPs、NP~(aFas)、NP~(Kb)、NP~(CD47)、NP~Kb/aFasb/aFas and NP~(Kb/aFas/PD-L1/TGFβ)等)的MST则分别为16、19、22、27、27、36和41天。第15天,H-2K~b-Ig二聚体的原位荧光染色显示,皮肤移植中浸润的H-2K~b同种抗原反应性T细胞减少79.8%;单抗荧光染色显示,皮肤移植物中浸润的CD8~+T细胞和CD4~+T细胞分别减少了48.9%和36.4%;HE染色显示炎性细胞的浸润也明显减少。另外,直径80 nm的杀伤性PLGA纳米粒的治疗仅使皮肤移植物的存活期延长了22天,效果明显弱于200 nm的杀伤性PLGA纳米粒,因此后续研究中只关注200 nm的杀伤性PLGA纳米粒。4、杀伤性PLGA纳米粒的体内作用机制:第叁次治疗后的2天(第15天),H-2K~(b-)Ig二聚体染色和流式分析显示,杀伤性PLGA纳米粒(Killer NPs)治疗组移植鼠脾脏淋巴细胞群中,H-2K~b特异性同种反应CD8~+T细胞的频率下降了90.3%,对照组CD47~-killer NPs(NP~(Kb/aFas/PD-L1/TGFβ))and Anti-Fas~-killer NPs(NP~(Kb/PD-L1/TGFβ/CD47))分别下降了62.6%和51.9%,而无关同种抗原靶向的对照组(H-2K~d killer NPs)只下降了12.6%。在外周血中,80.7%的H-2K~b特异性同种反应CD8~+T细胞被Killer NPs治疗所清除;同时,Killer NPs治疗导致移植鼠脾脏中CD8~+T细胞的凋亡率增高3倍,CD47~-killer NPs和Anti-Fas~-killer NPs对照组分别增高113.5%和48.2%,而H-2K~d killer NPs对照组只有轻微增高。外周血中的情况与此相似;Killer NPs治疗还使移植鼠脾脏活化状态的CD8~+T细胞频率下降了67.8%,使受者T细胞在体外与供者脾细胞混合培养中的同种增殖能力降低了50%;另外,Killer NPs治疗还导致移植鼠脾脏和淋巴结中CD4~+/CD25~+/Foxp3~+的调节性T细胞频率分别升高了81.7%和80.1%。5、杀伤性PLGA纳米粒的体内示踪、组织分布和与免疫细胞的接触:ICG标记的杀伤性PLGA纳米粒经尾静脉输注皮肤移植鼠,利用小动物活体远红外成像仪在不同时间点观察纳米粒的体内运行规律,另在2 h时取移植鼠各器官进行离体器官成像。结果显示,Killer NPs可通过血液系统分布于脾脏、淋巴结、肝、肾、肺、心脏和皮肤移植物局部,荧光强度在30 min至4 h间最强,体内滞留时间可达30 h以上。同时,H-2K~(b-)killer NPs(non-targeting killer NPs),CD47~-killer NPs和Blank NPs等对照纳米粒的体内运行和组织分布与Killer NPs呈现部分差异,且体内滞留时长明显缩短,分别为24 h,24 h和18 h。利用PE标记的Killer NPs经尾静脉输注皮肤移植鼠,流式分析也显示Killer NPs在外周血、脾脏和淋巴结中存在一定的频率;荧光单抗染色和激光共聚焦显微镜观察显示,移植鼠脾脏组织切片中,大量Killer NPs累积于红髓和边缘区,与CD8~+T细胞有较多的荧光共定位,而与CD4~+T细胞、B细胞、单核细胞和DC细胞接触较少。相比较而言,CD47~-killer NPs在红髓和边缘区分布较少,而与上述除B细胞外的诸多免疫细胞呈明显增多的荧光共定位。这些结果提示:在H-2K~b-Ig靶向抗原的引导下,killer NPs在体内可以与CD8~+T细胞直接接触,并且在CD47-Fc分子保护下被巨噬细胞和DC细胞吞噬的现象较少。6、杀伤性PLGA纳米粒治疗对机体整体免疫功能的影响和毒副作用:在killer NPs第叁次治疗后2天,流式分析显示移植鼠脾细胞群中CD3~+T细胞、CD4~+T细胞、B细胞和NK细胞的频率未明显下降;混合淋巴细胞培养实验显示受者T细胞对第叁方脾细胞的同种增殖能力没有明显下降;细胞毒实验显示NK细胞对肿瘤细胞的非特异性杀伤活性也没有下降;移植鼠载瘤实验显示killer NPs治疗并未显着降低治疗鼠的整体抗肿瘤能力。在killer NPs末次治疗后第2、17和32天,移植鼠血常规检测显示外周血中8种细胞群的数量或比例未有明显下降;生化指标分析显示肝功能和肾功能也未受明显损伤;各器官组织切片的HE染色结果显示移植鼠的脾、肾、肝、心和肺等重要脏器未见明显病理损伤。这些结果初步提示:killer NPs的体内治疗未导致移植鼠其他免疫细胞种群的明显的非特异性杀伤,未导致移植鼠整体免疫功能的明显下降和主要脏器的可见的毒副作用。结论:在PLGA纳米粒表面负载靶向抗原、多种负免疫调节分子和抗吞噬分子,成功制备直径200nm的、可生物降解的、多效能的杀伤性PLGA纳米粒。其经血液循环分布于同种皮肤移植鼠体内多种组织器官,在淋巴器官与同种抗原反应性CD8~+T细胞直接接触,诱导其凋亡、抑制其活化和同种增殖能力,促使调节性T细胞增殖,导致移植鼠体内大多数同种抗原反应性CD8~+T细胞被选择性清除,移植物局部浸润大幅减少,从而有效抑制皮肤移植排斥,大幅延长移植物存活期,同时对机体其他免疫细胞、整体免疫功能和主要脏器未见明显的毒副作用。本研究为同种异体移植排斥的特异性免疫疗法提供了新的策略和思路。(本文来源于《东南大学》期刊2018-06-04）
张璟[8]（2018）在《同质化异靶向杂合纳米粒递送索拉非尼与IMD-0354用于肝癌化学免疫治疗的研究》一文中研究指出原发性肝癌是世界范围内最常见的实体肿瘤类型之一,发病率居各种恶性肿瘤的第五位且近年来发病率不断增加。目前肝癌临床治疗主要有手术治疗、放射治疗、化学治疗及免疫治疗等手段。化学治疗对于不满足手术治疗条件的患者来说仍是肝癌治疗的重要手段。索拉非尼(Sorafenib,SF)是世界上首个也是唯一一个被批准应用于肝癌的多靶点分子靶向药物。但近年来,研究发现SF会引起免疫抑制作用,促进肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages,TAM)的不良极化,导致肝癌的不良预后与复发,因此,研究者仍在探索新的药物及新的治疗方案来增强肝癌治疗效果。近年来,免疫治疗的快速发展引领肿瘤治疗领域的重要突破和重大变革。在对肝癌患者病理分析及肝癌小鼠模型的分析中发现,TAM的浸润数量及表型类型可直接影响肝癌的发生、发展及转移。TAM是肿瘤微环境中一类重要的免疫细胞,也是免疫治疗研究中的重要靶细胞。TAM具有M1和M2两种表型,M1型巨噬细胞参与抗肿瘤免疫,具有肿瘤杀伤作用;M2型巨噬细胞分泌抗炎症因子,促进肿瘤生长,且在肿瘤微环境中大量存在,其密度增加与肝癌的预后不良之间密切相关。因此,以TAM为免疫治疗靶点对肝癌的治疗有重要意义。化学免疫联合治疗可协同两种治疗机制,化疗药物直接抑制或杀伤肿瘤细胞,同时通过免疫治疗作用与肿瘤微环境,调剂、激发并重建患者自身的免疫系统,加强抗肿瘤作用。课题将SF与TAM重极化药物联合应用,调节肿瘤相关巨噬细胞极化方向,使M2型TAM向肿瘤杀伤性M1型重极化,激活抗肿瘤免疫,缓解SF的免疫抑制作用,探索肝癌的化学免疫联合治疗新策略。抑制NF-κB通路,是调节TAM极化实现M2表型向M1表型重极化的有效方式。IMD-0354是一种选择性IKKβ抑制剂,可有效抑制NF-κ B通路,实现M2型TAM向肿瘤杀伤性M1型重极化。课题首次将SF与IMD-0354联用,以期协同两种抗肿瘤机制,在发挥SF抗肿瘤作用的同时,调节肿瘤微环境,激发机体自身免疫系统,增强肝癌治疗效果。SF与IMD-0354的理化性质差异、体内分布差异以及目标靶细胞不同等问题限制了 SF与IMD-0354联合治疗策略的实施。同质化载体为减小两种药物体内分布差异实现不同药物的相似组织分布提供可能。为更好的发挥化学免疫联合治疗效果,两种药物递送至肿瘤组织后,需靶向不同靶细胞分别发挥药效,SF靶向肿瘤细胞,IMD-0354靶向M2型TAM。因此构建一种在肿瘤微环境可由同质化转变为异质化的新型载体成为解决这一问题的关键。杂合纳米粒(Hybrid nanoparticles)是同时使用不同物理化学性质材料构建的新型载体,可以集合多种类型载体的优势,且具有结构上的层次性,经功能化修饰后可获得靶向及肿瘤微环境响应等功能,更易实现本课题同质化肿瘤部位递送及肿瘤部位不同靶细胞异靶向的目的。本文拟构建两种同质化异靶向杂合纳米粒,均用pH敏感外壳羧甲基壳聚糖(O-carboxymethyl-chitosan,CMCS)修饰以实现同质化,分别装载SF及IMD-0354 组成 SF 杂合纳米粒(CMCS modified Sorafenib cationic lipid-based nanosuspension,CMCS/SF-cLNS)及 IMD-0354 杂合纳米粒(CMCS modified and mannose modified IMD-0354 cationic lipid-based nanosuspension,CMCS/M-IMD-cLNS)。SF为分子靶向药物,分布于cLNS表面的SF可兼做靶向因子,介导载SF的内核载体自靶向肿瘤细胞;为实现肿瘤巨噬细胞的特异性递送,在载IMD-0354的内核上修饰M2型TAM靶向因子甘露糖,可在同质化外壳脱落后实现M2型TAM的靶向递送。两同质化载体共给药后,可在EPR作用下浓集于肿瘤部位,外壳pH响应性脱落后,两载药内核SF-cLNS和M-IMD-cLNS则分别进入肿瘤细胞及M2型TAM,SF发挥肿瘤杀伤作用,IMD-0354促使M2型TAM重极化为M1型,激活抗肿瘤免疫;两者通过不同机制相互协同,加强了肝癌治疗效果。主要研究内容及结果如下:第一章SF及IMD-0354含量测定方法的建立采用高效液相色谱的方法进行SF及IMD-0354的含量测定,并对该方法进行验证。测定结果表明,这种含量测定方法专属性及灵敏度好、精确度高、能准确测定杂合纳米粒中SF及IMD-0354的含量。第二章载SF杂合纳米粒构建利用纳米沉淀法及静电吸附法制备CMCS/SF-cLNS,单因素考察确定其最优处方。筛选出最优药脂摩尔比为1:6,DOTAP与脂质摩尔比为1:5,CMCS最优浓度为0.6 mg/mL。最优处方纳米粒形态圆整、粒径分布均匀。透射电镜照片显示其具有核壳结构,说明CMCS可以在静电作用下吸附于SF-cLNS表面,成功组装成杂合纳米粒。其粒径为117.9±3.4nm,电位为-21.1±2.5mV,载药量为5.22%±0.25%。在微酸性pH下,杂合纳米粒外壳可以敏感性脱落。同时pH 6.5时的药物累积释放量显着多于pH 7.4时(p<0.01)。在两种肝癌细胞系HepG2及Hepa1-6细胞中,CMCS/cLNS都表现出了 pH敏感性入胞增多的作用(在HepG2细胞p<0.05,Hepa1-6细胞p<0.001)。同时,在两种细胞系上,CMCS/SF-cLNS都表现出了比SF溶液更强的细胞毒性。第叁章载IMD-0354杂合纳米粒的构建成功合成了 M2型TAM的靶向材料M-DOPE,并用核磁图谱及红外图谱进行了表征。利用纳米沉淀法及静电吸附法制备CMCS/M-IMD-cLNS,单因素考察确定其最优处方。筛选出最优药脂摩尔比为2:9,DOTAP摩尔比为10%,CMCS最优浓度为0.6 mg/mL。最优处方纳米粒形态圆整、呈核壳结构,粒径为129.4±6.8 nm,电位为-25.5±0.8 mV,载药量为7.43%±0.51%,显示出与CMCS/SF-cLNS同质化的性质。CMCS外壳可在微酸性条件下脱落,同时pH 6.5时的药物累积释放量显着多于pH 7.4时(p<0.01)。细胞摄取实验结果显示,在巨噬细胞系RAW264.7中,CMCS/M-cLNS在pH 6.5时入胞比pH 7.4时明显增多。在竞争性抑制实验中,事先与游离甘露糖孵育组,M-cLNS入胞减少,证明M-cLNS可通过CD206受体介导的内吞途径入胞,实现M2型TAM的有效递送。TAM表型转化实验显示,CMCS/M-IMD-cLNS可有效促进M2型巨噬细胞向M1型重极化。第四章同质化异靶向杂合纳米粒共给药的体内外评价建立荷Hepa1-6的小鼠模型,通过活体成像实验,考察同质化异靶向杂合纳米粒共给药后小鼠体内组织的分布。结果表明CMCS/cLNS和CMCS/M-cLNS的体内分布行为相似,均可实现肿瘤部位药物蓄积。同质化载体联合治疗可有效促进M2型TAM重极化至M1型,并改善单独CMCS/SF-cLNS给药造成的免疫抑制作用。体内抗肿瘤实验及免疫组化实验证明,二者联合治疗后瘤体积及瘤重最小,与其他各组均有显着差异(p<0.05)。初步体内安全性评价结果表明,同质化异靶向杂合纳米粒联合给药后小鼠主要脏器无明显损伤,安全性良好。综上,本文构建两种同质化异靶向杂合纳米粒,分别装载SF及IMD-0354,两同质化纳米粒联合治疗能够促使M2型TAM重极化为M1型,有效改善SF单独使用所造成的的免疫抑制,激活抗肿瘤免疫,增强肝癌治疗效果。(本文来源于《山东大学》期刊2018-05-23）
胡春艳[9]（2018）在《聚合物纳米粒递送系统用于肿瘤化疗—光热治疗和免疫制剂的研究》一文中研究指出恶性肿瘤已经严重威胁人类健康。如今,肿瘤的治疗手段主要包括手术、化疗、放疗和免疫治疗。但是,这些方式都存在自身局限性从而限制了其在临床中的应用。手术对于已经转移的肿瘤基本无效;化疗由于缺乏肿瘤特异性可能会引起明显的毒副作用,并且长期的化疗会引起多药耐药性从而降低疗效。免疫疗法由于其显着的抗肿瘤效率吸引了大家的目光,但是这种治疗方式并不适用于所有病人。近年来,光热疗法作为一种非侵入式的肿瘤治疗手段引起大家的广泛关注。它利用光热试剂将近红外光转化成热,具有良好的温度选择和空间选择性,可以特异性选择肿瘤组织,而对正常组织产生相对低的毒性。但是由于光热疗法不均匀的热分散性,单独使用光热疗法并不能完全杀死肿瘤细胞从而引起肿瘤的复发或转移。因此,结合化疗和光热疗法可能是一种较好的肿瘤治疗策略。给肿瘤局部加热不仅使其温度升高杀死肿瘤细胞,而且加热诱导可以进一步增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,从而达到最佳的治疗效果。肿瘤的免疫治疗已经成为第四大治疗方式,成为目前全球研究的热点,被认为是目前唯一可能彻底治愈癌症的治疗手段。树突状细胞(DCs)治疗性肿瘤疫苗发展火热,将抗原、佐剂与细胞表面受体配基等制成疫苗直接靶向体内DC或者将荷载抗原和佐剂的DC回输到患者体内,产生保护性免疫反应。两种方法的最终目的都是活化抗原特异性CD4+和CD8+ T细胞,最大程度发挥抗肿瘤效应。DC疫苗安全性高,能够有效激发抗肿瘤免疫反应而无严重的毒副作用。聚合物纳米粒是一类优良的纳米递送载体,具有良好的生物相容性、生物可降解性和分子可设计性等特性。这些特性使得聚合物纳米粒在肿瘤的治疗中发挥重要作用。两亲性叁嵌段共聚物能在水溶液中自组装形成聚合物胶束或聚合物囊泡等结构。我们通过调节亲水性嵌段PEG和疏水性嵌段PCL的质量比分别获得聚合物胶束和聚合物囊泡,探索其在肿瘤的化疗-光热联合治疗和免疫治疗中的应用。具体内容如下:1.叶酸靶向还原敏感双重载药聚合物胶束的构建及其在肿瘤化疗-热疗联合治疗方面的研究本研究以具有良好生物可降解性和生物相容性的还原敏感性两亲性叁嵌段共聚物聚己内酯-SS-聚乙二醇-ss-聚己内酯(PCL-ss-PEG-ss-PCL,PCEP)为载体,以临床广泛使用的化疗药物-阿霉素和光敏剂-吲哚菁绿作为模型药物,叶酸为靶向配体,采用薄膜水化超声分散法构建了叶酸靶向还原敏感双重载药聚合物纳米胶束用于肿瘤的化疗-光热联合治疗。在该胶束中,阿霉素和吲哚菁绿均被包裹在聚合物胶束疏水内腔中。对所构建的聚合物胶束进行结构表征、体外细胞实验、动物体内分布等研究,评价其被动靶向和主动靶向能力。研究表明采用薄膜水化超声分散法制备的叶酸靶向还原敏感双重载药聚合物胶束粒径分布均匀,对DOX和ICG具有较高的载药量和包封率,具有粒径稳定性、还原敏感性和良好的光热转换效率。体外释放研究表明,FA-DINPs中阿霉素的释放受还原物质和近红外激光照射诱导影响。细胞摄取研究表明,对于无激光照射组,叶酸靶向修饰双载药胶束(FA-DINPs)的内吞效率高于无叶酸靶向双载药聚合物胶束(DINPs),而加入激光照射可以进一步增加乳腺癌细胞对聚合物胶束的摄取。体外细胞毒性实验表明,FA-DINPs有效降低了游离阿霉素的毒性,但比DINPs具有更强的细胞毒性,加上激光作用后发现化疗结合热疗组的细胞毒性最强。体内活体成像实验结果表明,FA-DINPs能够在肿瘤内有效积累,具有很强的靶向性。因此,叶酸靶向还原敏感双重载药聚合物纳米胶束是一种具有广泛应用前景的可同时递送化疗药物和光热试剂用于靶向肿瘤并协同治疗肿瘤的纳米制剂。2.负载模式抗原和双免疫激动剂的甘露糖修饰的磷脂杂化聚合物囊泡免疫效应的研究本研究以具有良好生物可降解性和生物相容性的两亲性叁嵌段共聚物聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯(PCL-PEG-PCL,PCEP)为载体,以卵清蛋白OVA为模式抗原,咪喹莫特(IMQ)和单磷酰脂质A(MPLA)为免疫激动剂,甘露糖(MAN)为靶向树突状细胞的官能基团,构建了甘露糖修饰、内外共载模式抗原和共包载双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物纳米囊泡(MAN-IMO-PS)。对该聚合物囊泡进行结构表征、体外释放、体外细胞毒性和体外吞噬分析;体内外评价MAN-IMO-PS对DCs的促成熟能力;动物实验考察MAN-IMO-PS在体内的分布和淋巴回流能力及在预防性动物模型中的抗肿瘤效应。TEM结果显示MAN-IMO-PS具有典型的双膜层结构,在正常生理条件下具有缓释抗原的能力。MAN-IMO-PS比IMO-PS具有更高的细胞摄取能力,细胞毒性结果表明MAN-IMO-PS具有良好的生物相容性。MAN-IMO-PS表现出抗原提呈细胞靶向性,增加了树突状细胞表面标志CD86、CD40的表达,相应的细胞因子TNF-α、IFN-γ等的表达上调。MAN-IMO-PS在体内表现出更强的淋巴细胞活化能力、效应性T细胞的免疫反应、CD8+T和CD4+T细胞应答及记忆性T细胞免疫反应。预防性动物模型结果显示,MAN-IMO-PS组能够延缓肿瘤的出现,具有更好的抑制肿瘤生长的效果。因此,通过肌肉注射甘露糖修饰的内外共载模式抗原并共递送免疫刺激剂的聚合物囊泡在抗肿瘤免疫治疗中具有广泛的应用前景。(本文来源于《北京协和医学院》期刊2018-05-01）
胡慧冰,侯昕宇,贺牧野,高峰[10]（2018）在《细菌外膜囊泡包覆的载药纳米粒的制备及其小鼠鼻腔免疫效果评价》一文中研究指出目的·制备细菌外膜囊泡(outer membrane vesicle,OMV)包覆的载卵清蛋白(ovalbumin,OVA)聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)copolymer,PLGA]纳米载体并用于小鼠鼻腔免疫效果评价。方法·采用超滤离心法制备OMV,采用乳化溶剂挥发法制备包载OVA的PLGA纳米粒(nanoparticle,NP),采用机械挤出法制备OMV包覆的PLGA载药NP,并对其进行表征。载OVA的OMV-PLGA NP经BALB/c小鼠鼻腔给药,用ELISA法检测鼻腔灌洗液、空肠黏膜和粪便中特异性sIgA抗体水平。结果·OMV包覆的PLGA载药NP粒径为(234.4±22.9)nm,透射电子显微镜观察其具有核壳结构。给药14 d后,载OVA的OMV-PLGA NP给药组在鼻腔灌洗液、空肠黏膜及粪便中sIgA抗体水平最高;与OMV+OVA给药组相比,载OVA的OMV-PLGA NP给药组在鼻腔灌洗液、空肠黏膜及粪便中的OVA特异性sIgA抗体水平分别提高了1.6、2.1和1.7倍,OMV特异性sIgA抗体水平均提高了1.5倍。结论·该纳米给药系统能同时使OMV和OVA被摄取与呈递,产生较强的小鼠黏膜免疫诱导反应。(本文来源于《上海交通大学学报(医学版)》期刊2018年02期）
免疫纳米粒论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
第一部分载aPD1靶向相变型纳米粒的制备及性能检测目的制备一种载程序性死亡受体1抗体(aPD1)、全氟戊烷(perfluoropentane,PFP)和四氧化叁铁(Fe3O4)的靶向纳米粒(GOP@aPD1),检测其粒径电位、稳定性、光热性能、相变特性、药物含量及药物释放等性能。方法首先制备粘附多肽(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser,GRGDS)靶向的聚乳酸羟基乙酸/聚乙二醇高分子材料(PLGA-PEG-GRGDS),并鉴定其化学结构。采用改良的叁步超声乳化法制备GOP@aPD1纳米粒(nanoparticles,NPs)。检测该纳米粒基本的理化性质,包括粒径、电位、形态结构、吸收光谱、傅里叶红外吸收峰及X射线光电子能谱分析吸收峰。于制备后不同时间点(0.5h,1d,3d,7d)测量纳米粒在PBS及含胎牛血清PBS溶液中粒径变化。流式细胞术检测纳米粒与GRGDS抗体连接情况。光镜下观察不同温度下(室温、37℃和45℃)纳米粒的相变情况。在660nm激光辐照下,检测不同浓度条件下该纳米粒的光热特性。观察660nm激光辐照后纳米粒不同时间点(2min,6min,10min,12min)超声增强信号。用酶联免疫吸附(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)测定检测GOP@aPD纳米粒内的aPD1药物含量,以及激光辐照触发aPD1药物释放情况。激光共聚焦观察GOP@aPD纳米粒对aPD1载药及释药情况。结果通过氢谱核磁分析对聚合物PLGA-PEG-GRGDS进行了结构确认。用超声乳化法制备的GOP@aPD1纳米乳呈棕褐色,扫描电镜(scanning electron microscopy,SEM)观察到该纳米粒呈球形结构,大小均一,分散度好。透射电镜(transmission electron microscope,TEM)显示点状Fe3O4颗粒均匀分布在该纳米粒内。马尔文粒径仪测得GOP@aPD1 NPs平均粒径218nm,平均电位为-5mV。在PBS及含10%胎牛血清PBS溶液4℃放置7天,GOP@aPD1 NPs粒径无明显改变,证明该纳米粒稳定性良好。流式细胞术测得对比非靶向纳米粒,GOP@aPD1 NPs与GRGDS抗体连接率更高,证明纳米粒表面修饰了GRGDS多肽。原子吸收光谱法测得GOP@aPD1 NPs中Fe3O4的包封率为63%。光学显微镜观察到,在室温及37℃条件下纳米粒基本保持稳定。但是在45℃纳米粒发生液气相变,体积增大,相互融合并破裂。说明GOP@aPD1 NPs相变温度约45℃。光声仪吸收光谱显示GOP@aPD1 NPs在700nm左右有强吸收峰。根据PLGA-PEG-GRGDS浓度,将GOP@aPD1 NPs稀释为1.25-10mg/mL。在660nm激光辐照下,不同浓度GOP@aPD1 NPs均有升温效果,且升高温度与纳米粒浓度正相关,其中5mg/mL组可升温达45℃左右。在660nm激光连续辐照下,纳米粒超声增强信号随时间呈逐渐上升-下降趋势,辐照10min纳米粒超声增强信号最大,说明其液气相变随激光辐照时间逐渐增强10min达高峰。ELISA测的GOP@aPD1 NPs中aPD1药物的载药量为1.56%(w/w),包封率为98.9%。体外药物释放试验显示,GOP@aPD1 NPs内的aPD1药物在激光辐照下2h内快速释放,6h后药物释放趋平缓。激光共聚焦显微镜观察到,在激光辐照前DiI标记GOP@aPD1 NPs的红色荧光与FITC标记aPD1的绿色荧光共定位呈黄色荧光信号,而在激光辐照后红色荧光与绿色荧光两者分离,说明激光辐照产生的光热效应促使GOP@aPD1 NPs释放其内负载的aPD1药物。结论本实验通过乳化法制备了GOP@aPD1纳米粒,形态规则,大小较均匀,性质稳定,负载aPD1及Fe3O4,具有较好的光热能力及液气相变的能力,能够在660nm激光辐照作用下释放aPD1药物。第二部分载aPD1靶向相变型纳米粒对黑色素瘤靶向性及体内分布研究目的观察GOP@aPD1 NPs在体外、体内对黑色素瘤细胞B16F10靶向性,以及该纳米粒的在体内的生物分布、血液中循环时间及体内生物安全性。方法首先制备GOP@aPD1 NPs与非靶向NPs。在体外实验中,激光共聚焦显微镜分别观察Di I标记的两组纳米粒与DAPI染色的B16F10细胞共定位情况,流式细胞术分别测量Di I标记的两组纳米粒与B16F10细胞孵育不同时间后连接率。CCK8法观察不同浓度(2.5mg/ml,5mg/ml,10mg/ml,15mg/ml)GOP@aPD1 NPs与B16F10细胞孵育后细胞活性变化。在体内实验中,首先建立C57B6鼠B16F10-luc黑色素瘤模型,当肿瘤体积大约长至约100mm3时,经C57B6鼠尾静脉分别注射Di R标记GOP@aPD1 NPs与非靶向NPs。在Xenogen IVIS生物发光成像系统中采集荧光图像,分析肿瘤及重要器官的信号强度。C57B6鼠尾静脉分别注射不同浓度(5mg/ml,10mg/ml)GOP@aPD1 NPs,14天后取小鼠血清分析CK、LDH-L、AST、ALT、BUN及CR水平,观察GOP@aPD1 NPs在体内生物安全性。用PerCP/Cy5.5标记的aPD1制备GOP@aPD1 NPs。经荷瘤C57B6鼠尾静脉分别注射PerCP/Cy5.5标记的GOP@aPD1 NPs及PerCP/Cy5.5标记的游离aPD1药物。注射后不同时间点(6h,10h)取肿瘤及重要器官,制备冰冻切片,在激光共聚焦显微镜下观察各组织切片中PerCP/Cy 5.5红色荧光信号,Image-Pro Plus 6.0软件分析信号强度。小鼠尾静脉注射PerCP/Cy5.5标记的GOP@aPD1 NPs后不同时间点(0.5h,1h,2h,4h,6h,8h,12h,24h)采集小鼠血液,进行荧光分光光度计分析。结果激光共聚焦显微镜观察到Di I标记GOP@aPD1 NPs的红色荧光,较Di I标记非靶向NPs的红色荧光更多的定位在B16F10细胞周围。GOP@aPD1 NPs及非靶向NPs与B16F10细胞孵育后2h及10h后,流式细胞术测得GOP@aPD1 NPs与细胞连接率显着高于非靶向NPs(p<0.01)。不同浓度GOP@aPD1 NPs(2.5mg/ml,5mg/ml,10mg/ml,15mg/ml)与B16F10细胞孵育后细胞活性无显着变化。但B16F10细胞与GOP@aPD1 NPs孵育后再接受激光辐照后细胞活性显着降低,且细胞活性随GOP@aPD1 NPs浓度升高而降低。在体内靶向性实验中,GOP@aPD1 NPs通过高通透性和滞留(enhanced permeability and retention,EPR)效应及主动靶向性在肿瘤部位逐渐富集,小动物活体荧光观察到肿瘤部位荧光信号随时间推移而逐渐增强,在给药6h后达到最高峰、24h后减弱。在非靶向NPs组,小鼠肿瘤部位各时间点荧光信号均显着低于GOP@aPD1 NPs组。在C57B6鼠尾静脉分别注射不同浓度GOP@aPD1 NPs(5mg/ml,10mg/ml)14天后,血清CK、LDH-L、AST、ALT、BUN及CR变化无统计学差异。经荷瘤鼠尾静脉分别注射PerCP/Cy5.5标记的GOP@aPD1 NPs 6h及24h后,通过激光共聚焦显微镜均可观察到肿瘤组织中GOP@aPD1NPs红色荧光信号。但在PerCP/Cy5.5标记的aPD1游离药物组,通过激光共聚焦显微镜几乎不能观察到肿瘤组织中红色荧光信号。肿瘤组织中荧光信号强度分析显示,在6h及24h时间点GOP@aPD1 NPs组肿瘤组织中aPD1荧光强度均显着高于aPD1游离药物组。荷瘤鼠尾静脉注射PerCP/Cy5.5标记的GOP@aPD1 NPs 24h后,仍可通过荧光分光光度计检测血液中荧光信号。GOP@aPD1 NPs在体内循环的半衰期约4.39h。结论制备的GOP@aPD1 NPs可通过EPR效应及主动靶向性在肿瘤组织中富集,实现靶向黑色素瘤递送aPD1药物,并具有较长的体内循环时间及良好的生物安全性,为下一步体内治疗实验奠定了基础。第叁部分光热介导载aPD1靶向相变型纳米粒治疗恶性黑色瘤及增效免疫治疗机制研究目的研究光热(Photothermal therapy,PTT)介导GOP@aPD1NPs治疗黑色素瘤的效果,及其增效aPD1免疫治疗的相关机制。方法为了观察光热介导GOP@aPD1 NPs在体内光热效应,建立C57B6鼠B16F10-luc黑色素瘤模型,当肿瘤体积约80mm3时开始给予不同处理。把荷瘤小鼠随机分成3组,对照组(不处理),PTT组及GOP@aPD1+PTT组。其中GOP@aPD1+PTT组先经小鼠尾静脉注射GOP@aPD1 NPs(~200μL,5mg/m L),6h后给予肿瘤部位660nm激光辐照(0.1W/cm2,10min)。PTT组仅给予660nm激光辐照(0.1W/cm2,10min)肿瘤组织。用红外热成像仪观察肿瘤部位的升温情况。小鼠经处理后不同时间点(24h,72h,168h)取血清,通过ELISA分析炎症因子IL-6、TNF-α及IFN-γ变化水平。为了观察光热介导GOP@aPD1 NPs在体内对恶性黑色素瘤治疗作用,首先制备GOP@aPD1 NPs,单载Fe3O4 NPs及单载aPD1 NPs。其中单载Fe3O4 NPs不含aPD1,单载aPD1 NPs不含Fe3O4。建立C57B6鼠B16F10-luc黑色素瘤模型,当肿瘤体积大约80 mm3时开始于不同处理。把小鼠随机分成8组,1.对照组(生理盐水),2.游离aPD1组,3.PTT组,4.游离aPD1+PTT组,5.单载Fe3O4 NPs+PTT组,6.单载aPD1NPs+PTT组,7.GOP@aPD1组,8.GOP@aPD1+PTT组。其中2及7组仅分别静脉注射游离aPD1及GOP@aPD1 NPs;3组仅给予肿瘤部位660 nm激光辐照(0.1W/cm2,10min);4、5、6及8组分别先经小鼠尾静脉注射游离aPD1、单载Fe3O4 NPs、单载aPD1 NPs及GOP@aPD1NPs,6h后给予肿瘤部位660nm激光辐照(0.1W/cm2,10min)。经过不同的处理后,观察小鼠的肿瘤体积大小、体重和生存期。在处理后不同时间点(0d、7d、14d)小鼠腹腔注射luc荧光素底物,Xenogen IVIS生物发光成像系统中采集肿瘤荧光信号。在处理7d后,每组随机处死小鼠,收集心、肝、脾、肺、肾和肿瘤组织进行苏木精伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色,并对肿瘤组织进行TUNEL免疫荧光染色检测肿瘤细胞的增殖和凋亡。为研究光热介导GOP@aPD1 NPs增效aPD1免疫治疗的机制。实验中小鼠分组及处理同上。在处理7d后处死小鼠,收集肿瘤组织进行流式细胞术及免疫荧光染色检测肿瘤浸润T淋巴细胞数量,CD8+T淋巴细胞及CD4+T淋巴细胞亚群的比例。结果体内光热反应实验发现,PTT组及GOP@aPD1+PTT组给予激光辐照后,肿瘤部位的最高温度分别达到约42℃和45℃,均可产生光热效果。但ELISA分析血清炎症因子IL-6、TNF-α及IFN-γ结果显示,GOP@aPD1+PTT组动物血清炎症因子水平显着高于PTT组。在处理后72h,GOP@aPD1+PTT组血清IFN-γ水平是PTT组3.5倍;在处理后168h后,GOP@aPD1+PTT组血清IFN-γ水平是PTT组3倍。这部分结果证明了光热介导GOP@aPD1 NPs治疗可产生肿瘤光热治疗效应,并有效地激活体内炎症反应水平。在体内黑色素瘤治疗观察中,游离aPD1组、PTT组、单载Fe3O4NPs+PTT组及GOP@aPD1组肿瘤生长未受到明显的抑制作用,和对照组的肿瘤生长无明显差异。在游离aPD1+PTT组及单载aPD1NPs+PTT组中,肿瘤生长受到了一定程度的抑制。然而GOP@aPD1+PTT组肿瘤生长受到了几乎完全抑制。活体荧光实验显示,在治疗14天时GOP@aPD1+PTT组肿瘤荧光强度最弱。GOP@aPD1+PTT组动物生存期均超过35天,而游离aPD1+PTT组及单载aPD1 NPs+PTT组动物平均生存期分别为19天及20天。肿瘤组织HE染色发现,GOP@aPD1+PTT组肿瘤组织可见大量肿瘤细胞坏死,无完整细胞结构,镜下呈红染无结构区,且TUNEL免疫荧光染色结果显示该组肿瘤组织的凋亡荧光最高。各组主要器官的HE染色均未见明显异常,证明了该治疗方式的生物安全性。激光共聚焦显微镜发现对照组肿瘤组织切片中几乎没有肿瘤浸润T淋巴浸润,而GOP@aPD1+PTT组肿瘤组织切片中可见大量CD3+T淋巴细胞,CD8+T淋巴细胞及CD4+T淋巴细胞浸润。流式细胞术分析肿瘤微环境中浸润T淋巴细胞数量及亚群结果显示,GOP@aPD1+PTT组肿瘤浸润CD3+T淋巴细胞数量在各组中最高,且CD8+T淋巴细胞比例也在各组中最高。证明了光热介导的GOP@aPD1NPs治疗有效提高了肿瘤组织微环境中抗肿瘤效应T细胞量,从而增效aPD1免疫治疗疗效。结论光热介导的GOP@aPD1 NPs治疗,提高了体内抗肿瘤炎症反应水平,增加了肿瘤微环境T淋巴细胞量,实现免疫“冷”肿瘤向免疫“热”肿瘤转变,从而增强aPD1的免疫治疗效果,有效地抑制恶性黑色素瘤生长,为恶性黑色素治疗提供一种新途径。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
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