首页> 正文

自噬蛋白Atg4.1和Atg4.4在嗜热四膜虫程序化核降解中的功能分析

2020-12-08阅读(324)

自噬蛋白Atg4.1和Atg4.4在嗜热四膜虫程序化核降解中的功能分析

论文摘要

自噬通过溶酶体降解生物大分子或细胞器用以维持细胞稳态,是生物体内一种重要的分解代谢过程,不同功能的自噬相关蛋白有序调控这一过程,在不同的生物体中进化出多样化的自噬信号通路。嗜热四膜虫中亲本大核程序性死亡（programmed nuclear death,PND）是一种独特的细胞核自噬,多种自噬相关蛋白可能参与调控PND过程。本研究从嗜热四膜虫中鉴定了Tt ATG4.1和TtATG4.4两种同源基因,并对这两种基因的功能进行了分析。主要结果如下:1.TtATG4.1和TtATG4.4生物信息学分析在四膜虫基因组数据库（http://www.ciliate.org）中进行同源序列比对发现4个C54肽酶家族蛋白,分别是TtAtg4.1、TtAtg4.2、TtAtg4.3和TtAtg4.4。四种自噬蛋白Atg4作为半胱氨酸蛋白酶均有保守的催化活性中心Cys,并且具有Atg4蛋白高度保守的GWGCM模体。Atg4蛋白的聚类与物种进化基本一致,嗜热四膜虫中的四种同源蛋白可能拥有不同的功能,在PND过程中有着各自的分工。其中TtATG4.1在有性生殖时期特异表达,在8h表达量最高;而TtATG4.4在有性生殖12 h表达量最高,这与亲本大核发生程序化降解的时间相吻合,暗示TtAtg4.1和TtAtg4.4可能参与调控PND。2.TtATG4.1参与PND过程亲本大核的降解为研究TtAtg4.1的功能,融合HA标签的过表达载体pXS75-ATG4.1转化四膜虫,筛选获得过表达Atg4.1细胞株。HA-Atg4.1定位于细胞质和程序化降解的亲本大核上。经Cd2+诱导HA-Atg4.1过量表达,不影响亲本大核核膜与自噬溶酶体的互融及正常酸化,但是促进了亲本大核降解,表明Atg4.1可能参与调控PND过程。进一步,我们构建了ATG4.1的RNAi干扰细胞株,RNA干扰ATG4.1引起亲本大核异常降解及发育延迟,自噬溶酶体好像逐步“分解啃食”亲本大核内容物,并且Atg8定位受到影响,部分Atg8蛋白弥散在细胞质中。敲减ATG4.1后可能影响了Atg8正常功能的发挥,导致Atg8与磷脂酰乙醇胺的结合受阻。3.TtATG4.4参与调控减数分裂小核和亲本大核的降解TtATG4.4在有性生殖2 h和12 h有高表达。我们构建了ATG4.4的RNAi干扰突变细胞株,ATG4.4敲减,抑制了小核减数分裂,有性生殖停止。融合HA标签的过表达载体pXS75-ATG4.4转化四膜虫,筛选获得过表达Atg4.4突变细胞株。免疫荧光定位表明HA-Atg4.4蛋白定位在在嗜热四膜虫有性生殖程序化降解的亲本大核上,经Cd2+诱导过量表达后,小核减数分裂产物的降解受到影响,在接合8 h仍能观察到未降解的减数分裂小核,而亲本大核在接合8 h未能正常移动到细胞后端,且亲本大核细胞核松散膨胀。结果表明Atg4.4可能既参与调控小核减数分裂,还参与调控PND过程亲本大核的降解。本研究首次鉴定了嗜热四膜虫自噬相关基因TtATG4.1和TtATG4.4,两种自噬相关基因均参与了PND中亲本大核的降解,而TtATG4.4基因可能调控自噬途径来影响小核减数分裂。这些结果表明Atg4.1和Atg4.4在功能上有不同的分工。这些自噬相关基因的鉴定为进一步了解PND过程的降解机制以及自噬相关蛋白在其中发挥的功能奠定了基础。

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 第一章 文献综述
  •   1.1 自噬
  •   1.2 自噬相关蛋白Atg
  •   1.3 细胞核自噬
  •   1.4 嗜热四膜虫是研究选择性自噬的模式体系
  •   1.5 嗜热四膜虫细胞核自噬研究进展
  •   1.6 本课题的研究意义
  • 第二章 嗜热四膜虫中ATG4基因的生物信息学分析
  •   2.1 材料
  •     2.1.1 细胞株
  •     2.1.2 主要试剂和工具酶
  •     2.1.3 实验使用引物
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 生物信息学分析
  •     2.2.2 嗜热四膜虫细胞的培养、饥饿和配对
  •     2.2.3 嗜热四膜虫基因组的提取
  •     2.2.4 嗜热四膜虫RNA的提取
  •     2.2.5 嗜热四膜虫cDNA的合成
  •     2.2.6 野生型嗜热四膜虫ATG4.1和ATG4.4 基因的实时荧光定量分析
  •     2.2.7 实时荧光定量数据处理
  •     2.2.8 野生型嗜热四膜虫ATG4.1和ATG4.4 基因的克隆
  •   2.3 结果与讨论
  •     2.3.1 嗜热四膜虫中的Atg4 自噬相关蛋白
  •     2.3.2 嗜热四膜虫Atg4 蛋白系统发育树分析
  •     2.3.3 基因ATG4.1 的克隆
  •     2.3.4 基因ATG4.4 的克隆
  •     2.3.5 Tt ATG4.1和Tt ATG4.4 表达谱分析
  • 第三章 嗜热四膜虫中基因ATG4.1 的功能分析
  •   3.1 材料
  •     3.1.1 细胞株和质粒
  •     3.1.2 主要试剂和工具酶
  •     3.1.3 实验所需引物
  •   3.2 实验方法
  •     3.2.1 嗜热四膜虫的培养、饥饿和配对
  •     3.2.2 重组表达质粒pXS75-ATG4.1 的构建
  •     3.2.3 重组表达质粒RNAi-ATG4.1 的构建
  •     3.2.4 细胞转化与稳定细胞突变株的筛选
  •     3.2.5 间接免疫荧光定位
  •     3.2.6 嗜热四膜虫细胞有性生殖时期的观察
  •     3.2.7 活细胞荧光探针标记与观察
  •     3.2.8 统计学方法
  •   3.3 结果
  •     3.3.1 Atg4.1 在四膜虫有性生殖时期定位于细胞质中和程序化降解的亲本大核上
  •     3.3.2 过表达Atg4.1 促进亲本大核降解
  •     3.3.3 过表达Atg4.1 不影响亲本大核的酸化
  •     3.3.4 过表达Atg4.1 不影响Atg8 在亲本大核上的定位
  •     3.3.5 干扰ATG4.1 引起亲本大核异常降解及发育延迟
  •     3.3.6 在干扰ATG4.1 细胞株中自噬溶酶体啃食亲本大核
  •     3.3.7 干扰ATG4.1 阻碍Atg8 蛋白的定位
  •   3.4 讨论
  • 第四章 嗜热四膜虫中ATG4.4 基因的功能分析
  •   4.1 材料
  •     4.1.1 细胞株和质粒
  •     4.1.2 主要试剂和工具酶
  •     4.1.3 实验所需引物
  •   4.2 实验方法
  •     4.2.1 嗜热四膜虫的培养、饥饿和配对
  •     4.2.2 重组表达质粒pXS75-ATG4.4 的构建
  •     4.2.3 重组表达质粒RNAi-ATG4.4 的构建
  •     4.2.4 细胞转化与稳定细胞突变株的筛选
  •     4.2.5 间接免疫荧光定位
  •     4.2.6 嗜热四膜虫细胞有性生殖时期的观察
  •     4.2.7 活细胞荧光探针标记与观察
  •     4.2.8 统计学方法
  •   4.3 结果
  •     4.3.1 干扰ATG4.4 影响小核减数分裂
  •     4.3.2 干扰ATG4.4 细胞株自噬溶酶体仍能正常富集
  •     4.3.3 HA-Atg4.4 在嗜热四膜虫有性生殖过程中定位在程序化降解的亲本大核上
  •     4.3.4 过表达Atg4.4 影响生殖小核减数分裂产物和亲本大核的降解
  •   4.4 讨论
  • 参考文献
  • 总结与展望
  • 附录
  • 攻读学位期间取得的研究成果
  • 致谢
  • 个人简况及联系方式

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 郑文萍

    导师: 王伟

    关键词: 自噬相关蛋白,选择性自噬,嗜热四膜虫,细胞核程序化降解

    来源: 山西大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 山西大学

    分类号: Q78

    DOI: 10.27284/d.cnki.gsxiu.2019.000204

    总页数: 68

    文件大小: 43946K

    下载量: 32

    相关论文文献

    • [1].嗜热四膜虫减数分裂研究进展[J]. 动物学杂志 2016(01)
    • [2].应用嗜热四膜虫评估苯甲酸钠的生物毒性[J]. 食品与生物技术学报 2016(05)
    • [3].嗜热四膜虫功能基因组数据库[J]. 中国科学数据(中英文网络版) 2016(02)
    • [4].嗜热四膜虫在评价珠江广州段水体中的应用初探[J]. 现代预防医学 2017(20)
    • [5].草铵膦对四膜虫毒性作用的研究[J]. 生物学杂志 2016(04)
    • [6].嗜热四膜虫可变剪接基因鉴定及功能分析[J]. 基因组学与应用生物学 2015(01)
    • [7].嗜热四膜虫的培养条件优化及其扩大培养研究[J]. 基因组学与应用生物学 2014(02)
    • [8].低剂量三氯生和三氯卡班对嗜热四膜虫的毒性研究[J]. 环境化学 2012(05)
    • [9].四膜虫在科研上的应用研究进展[J]. 科技信息 2011(08)
    • [10].嗜热四膜虫在东江东莞段水质评价中的应用[J]. 环境与健康杂志 2019(01)
    • [11].当归补血汤作用于四膜虫抗氧化基因——抗氧化药物筛选新方法初探[J]. 中国现代中药 2016(07)
    • [12].由一道试题引起对“四膜虫”的展望[J]. 中学生物学 2015(04)
    • [13].三聚氰胺对单细胞生物四膜虫的影响[J]. 环境与健康杂志 2010(01)
    • [14].淄博市孝妇河不同区段水质对四膜虫有性生殖的影响[J]. 安徽农学通报(上半月刊) 2010(11)
    • [15].四膜虫基因表达数据库:四膜虫全基因组基因表达芯片和协同表达分析的数据资源[J]. 中国科学:生命科学 2010(12)
    • [16].乌头类双酯型生物碱对嗜热四膜虫生长的毒性效应微量热学研究[J]. 化学学报 2010(03)
    • [17].环境相关浓度三氯生和三氯卡班暴露对嗜热四膜虫体内抗氧化酶活力的影响[J]. 环境与健康杂志 2013(12)
    • [18].嗜热四膜虫两类不同金属硫蛋白的功能补偿分析[J]. 水生生物学报 2014(02)
    • [19].低浓度头孢类抗生素暴露对嗜热四膜虫超氧化物歧化酶和乳酸脱氢酶活力的影响[J]. 环境与健康杂志 2012(09)
    • [20].氧化石墨烯对嗜热四膜虫的毒性效应[J]. 中国环境科学 2019(03)
    • [21].细胞应激条件下嗜热四膜虫线粒体膜电位变化研究[J]. 复旦学报(自然科学版) 2012(03)
    • [22].七性生物暗藏世间[J]. 生物学通报 2013(04)
    • [23].嗜热四膜虫胱硫醚γ-裂解酶Cgl1的表达、定位及功能分析[J]. 中国生物化学与分子生物学报 2019(03)
    • [24].嗜热四膜虫异染色质蛋白Tcd1磷酸化位点的突变分析[J]. 中国生物化学与分子生物学报 2018(05)
    • [25].国家蛋白质科学中心(上海)科研人员揭示四膜虫端粒酶组分p75-p45-p19是其独特的CST复合物[J]. 生命的化学 2015(06)
    • [26].抗沉默因子Asf1调控嗜热四膜虫细胞核的稳定性[J]. 中国生物化学与分子生物学报 2015(01)
    • [27].不同苯系物对四膜虫和大肠杆菌的毒性及其机理研究[J]. 科技经济导刊 2019(18)
    • [28].绿色荧光蛋白表达载体pXS75-GFP的构建及在嗜热四膜虫中的应用[J]. 中国细胞生物学学报 2012(10)
    • [29].嗜热四膜虫Ran结合蛋白1的表达对大小核分裂的影响[J]. 中国生物化学与分子生物学报 2013(04)
    • [30].四膜虫锌指结构蛋白Zfp1影响离子胁迫下金属硫蛋白基因的表达[J]. 山西大学学报(自然科学版) 2019(01)

    标签：;  ;  ;  ;  

    自噬蛋白Atg4.1和Atg4.4在嗜热四膜虫程序化核降解中的功能分析
    下载Doc文档

    猜你喜欢

    © 2024 神降笔 版权所有 鄂ICP备12018319号-6