内源小干扰RNA在小鼠母源mRNA降解中的功能研究

论文摘要

哺乳动物早期胚胎发育是指卵母细胞受精并发育到囊胚的整个过程,在此期间发生数个标志性关键事件,如母源因子降解、合子基因激活、卵裂球致密化、桑囊转换等。胚胎早期发育机制的深度解析对辅助生殖的发展具有至关重要的推进作用。大多数体外成熟的卵母细胞在形态学上是正常的,但在受精之后出现发育缺陷,其中母源因子降解异常就是原因之一。母源因子是指在卵母细胞发生过程中在细胞质中合成并储存的RNA和蛋白质等,对于调控早期胚胎发育是必需的,随着胚胎发育的进行,其功能逐渐被合子基因组的产物所取代,母源因子逐渐发生降解。母源因子降解主要体现为母源mRNA的降解,其主要通过母源通路和合子通路相互配合实现。前期的研究揭示了RNA结合蛋白、microRNA（miRNA）和piwi-interacting RNA（piRNA）在母源mRNA降解过程中的功能机制,而近年来越来越受关注的内源性小干扰RNA（endo-siRNA）在此事件中的功能一直没有被深入研究。Endo-siRNA在转录后水平对基因表达具有重要的负调控作用,预示着其在母源mRNA降解过程中可能具有重要功能。据此,本研究对endo-siRNA在小鼠早期胚胎中母源mRNA降解中的功能进行探究。本研究首先通过生物信息学对母源基因及对应小RNA进行筛选与鉴定,共鉴定出2730个母源基因及对应的9148条endo-siRNAs和72条miRNAs。表达模式分析发现,endo-siRNAs主要在二细胞期前高水平表达,在四细胞期显著下调,而miRNA则是在二细胞阶段才出现表达量上调,而此时大部分母源mRNA已经完成降解,而endo-siRNA主要存在于卵母细胞、一细胞和二细胞期胚胎中,其表达模式与母源mRNA表达模式存在负相关,预示着endo-siRNA在小鼠母源mRNA降解中可能具有关键作用。Endo-siRNA的形成主要依赖Dicer,实验通过在合子期注射Dicer干扰片段和抗体,对其mRNA和蛋白的表达进行敲低,检测endo-siRNA的缺失对母源mRNA降解的影响。单细胞转录组测序结果表明,Dicer敲低导致1164个基因表达水平出现异常,其中上调基因462个,其中母源基因只有71个,暗示endo-siRNA在合子通路中功能有限,可能主要通过母源通路发挥功能。随后通过RT-PCR和qPCR对筛选的母源基因Spin、Zfp277和Brip及其对应endo-siRNAs的表达进行检测,结果显示母源mRNA的表达模式确实和endo-siRNA存在负相关,进一步通过注射endo-siRNAs的模拟物和阻遏物,明确endo-siRNA在母源mRNA降解过程中发挥着重要功能,并且通过mRNA降解实验,证明endo-siRNA在转录后水平促进母源mRNA的降解。本研究对endo-siRNA的形成机制进行解析,通过序列比对发现一条lncRNA（lnc521）,在endo-siRNA形成的区域与母源基因Zfp277形成互补。Lnc521特异性地在一细胞期高表达,并在细胞质中特异性表达。通过RNA干扰技术,发现lnc521敲低显著影响了Zfp277相应endo-siRNA的形成,并且通过显微注射322bp的lnc521序列,可以有效地补偿endo-siRNA的形成,并且恢复了母源基因Zfp277的降解,这表明母源基因Zfp277对应的endo-siRNA形成是lnc521依赖性的。在哺乳动物早期胚胎发育过程中,母源因子向合子转录物转换具有重要意义,在这个过程中母源因子迅速发生降解,被胚胎产生的新物质替代。本研究结果表明,endo-siRNA在转录后水平促进母源mRNA降解,为母胚转换机制研究开启新的方向。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 1 前言
•   1.1 胚胎早期发育与母源因子
•     1.1.1 胚胎早期发育概述
•     1.1.2 母源因子概述
•     1.1.3 母源因子降解的发现
•     1.1.4 母源因子降解与腺苷酸化
•     1.1.5 母源因子的母源降解通路
•     1.1.6 母源因子的合子降解通路
•     1.1.7 母源因子降解的空间调控
•   1.2 小RNA与母源因子降解
•     1.2.1 MiRNA与母源因子降解
•     1.2.2 PiRNA与母源因子降解
•     1.2.3 Endo-siRNA与母源因子降解
•   1.3 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 实验动物
•     2.1.2 主要仪器设备
•     2.1.3 主要试剂及试剂盒
•     2.1.4 主要引物列表
•     2.1.5 常用试剂及配制
•     2.1.6 常用生物信息学分析软件
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 各时期小鼠胚胎获取
•     2.2.2 RNA干扰
•     2.2.3 显微固定针与注射针制备
•     2.2.4 显微注射
•     2.2.5 总RNA提取
•     2.2.6 总RNA反转录
•     2.2.7 小RNA提取
•     2.2.8 小RNA反转录
•     2.2.9 核质定位分析
•     2.2.10 PCR
•     2.2.11 琼脂糖凝胶电泳
•     2.2.12 荧光定量PCR
•     2.2.13 EU染色
•     2.2.14 体外转录
•     2.2.15 RNA-FISH
• 3 结果与分析
•   3.1 母源基因及对应endo-siRNA的筛选与鉴定
•     3.1.1 母源基因的筛选
•     3.1.2 母源mRNA相关小RNA的筛选
•     3.1.3 母源mRNA与小RNA表达模式相关性分析
•   3.2 Dicer对母源mRNA降解的影响
•     3.2.1 Dicer敲低效率检测
•     3.2.2 Dicer敲低不影响合子基因激活
•     3.2.3 Dicer敲低不影响早期胚胎发育
•     3.2.4 Dicer敲低对小鼠胚胎转录组的影响
•   3.3 母源mRNA及endo-siRNA表达模式检测
•     3.3.1 RT-PCR检测endo-siRNA表达
•     3.3.2 母源mRNA及 endo-siRNA表达模式检测
•   3.4 Endo-siRNA对母源mRNA降解的机制研究
•   3.5 Endo-siRNA形成机制探究
•     3.5.1 LncRNA的筛选
•     3.5.2 lnc521亚细胞定位分析
•     3.5.3 lnc521过表达可以补偿endo-siRNA的形成
•     3.5.4 lnc521对母源mRNA降解的影响
• 4 讨论
•   4.1 母源基因的筛选
•   4.2 母源基因对应endo-siRNA的鉴定
•   4.3 Dicer介导endo-siRNAs的形成时期
•   4.4 Endo-siRNA在转录后水平调控母源mRNA降解
•   4.5 lnc521与endo-siRNA形成
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张加明

导师: 孔庆然

关键词: 小鼠,早期胚胎发育,母源因子,内源小干扰

来源: 东北农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 东北农业大学

分类号: Q344

总页数: 70

文件大小: 4945K

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