导读:本文包含了反义肽核酸论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:核酸,探针,铜绿,西林,分子,核苷酸,平滑肌。
反义肽核酸论文文献综述
张峰领[1]（2017）在《铜绿假单胞菌las群体感应系统反义肽核酸的构建及其生物学作用研究》一文中研究指出目的1.针对铜绿假单胞菌las群体感应系统的lasR/lasI基因,设计和筛选出与其mRNA紧密结合的反义寡核苷核酸序列,以此为基础设计合成反义肽核酸。2.评估反义肽核酸对铜绿假单胞菌PAO1的生长、lasR/lasI基因表达、生物被膜形成及毒力因子表达的影响。方法一、铜绿假单胞菌PAO1 lasR和lasI基因反义肽核酸的设计与筛选1.铜绿假单胞菌PAO1 lasR和lasI基因反义寡核苷酸的设计与筛选1.1目的基因的扩增:根据Gene Bank数据库提供的铜绿假单胞菌PAO1 lasR和lasI全长基因序列,用软件Primer Primer 6.0设计扩增引物,进行lasR和lasI基因的PCR扩增。1.2构建lasR和lasI基因mRNA表达质粒:回收并纯化lasR和lasI基因扩增产物,与质粒载体p GEM-T easy vector进行连接重组。1.3重组质粒p GEM-T easy vector-lasR/lasI的验证:重组质粒转化感受态细菌DH5α,利用蓝白斑实验筛选出阳性克隆。扩增后提取p GEM-T easy vector-lasR/lasI质粒并进行p GEM-T easy vector-lasR/lasI Not I酶切鉴定和测序鉴定。1.4利用软件RNA structure 5.2设计lasR和lasI基因mRNA反义寡核苷酸序列。1.5反义寡核苷酸的筛选:进行lasR/lasI mRNA体外转录,利用斑点杂交实验筛选出反义寡核苷酸序列。2.铜绿假单胞菌PAO1 lasR和lasI基因反义肽核酸的设计与合成依据筛选出的反义寡核苷酸序列,按照肽核酸设计原则设计合成铜绿假单胞菌PAO1 lasR和lasI基因反义肽核酸,并将其与穿膜肽(KFF)3K连接。二、铜绿假单胞菌PAO1 lasR和lasI基因反义肽核酸生物学作用研究1.反义肽核酸对铜绿假单胞菌PAO1 lasR和lasI基因表达的影响:利用q PCR方法检测lasR和lasI基因mRNA相对表达量。2.反义肽核酸对铜绿假单胞菌PAO1生长的影响:酶标仪测定LB液体培养基中铜绿假单胞菌PAO1 OD600和LB固体培养基计数菌落。3.反义肽核酸对铜绿假单胞菌PAO1生物被膜形成的影响:光学显微镜、扫描电镜和激光共聚焦显微镜观察生物膜内细菌含量。4.反义肽核酸对铜绿假单胞菌PAO1毒力因子表达的影响:采用ELISA技术检测铜绿假单胞菌PAO1外毒素A、绿脓菌素含量的变化,q PCR方法检测弹力蛋白酶lasB基因mRNA相对表达量。结果一、铜绿假单胞菌PAO1 lasR和lasI基因反义肽核酸的设计与筛选1.成功构建lasR和lasI基因mRNA表达重组质粒p GEM-T easy vector-lasR/lasI,筛选出与铜绿假单胞菌PAO1 lasR和lasI基因mRNA紧密结合的反义寡核苷酸序列。2.以筛选出的反义寡核苷酸序列为基础合成反义肽核酸,并将其与穿膜肽结合构建了穿膜肽-反义肽核酸。二、铜绿假单胞菌PAO1 lasR和lasI基因反义肽核酸生物学作用研究1.lasR/lasI穿膜肽-反义肽核酸抑制lasR/lasI mRNA的表达,与对照组相比,其表达量有显着差异,并且随着穿膜肽-反义肽核酸浓度增加,对lasR/lasI mRNA的表达抑制作用增强。2.lasR/lasI穿膜肽-反义肽核酸浓度≧40μM时,对铜绿假单胞菌PAO1的生长有明显抑制作用,浓度越高,对生长的抑制作用越明显。而穿膜肽和反义肽核酸本身对细菌的生长无明显抑制作用。3.光学显微镜、扫描电镜和激光共聚焦显微镜观察结果显示,lasR/lasI穿膜肽-反义肽核酸转染的铜绿假单胞菌PAO1,其生物被膜的形成明显抑制。4.lasR/lasI调控的毒力因子弹性蛋白酶lasB、绿脓菌素和外毒素A等在穿膜肽-反义肽核酸的作用下表达量均下降,与阴性对照组相比,差异有统计学意义。结论1.通过体外表达和斑点杂交实验,成功效筛选出与目的基因lasR/lasI mRNA紧密结合的反义寡核苷酸序列,并在此基础上成功设计合成反义肽核酸并构建了穿膜肽连接的穿膜肽-反义肽核酸。2.穿膜肽-反义肽核酸明显抑制lasR/lasI mRNA的表达,实现对铜绿假单胞菌las群体感应系统的淬灭。3.lasR/lasI mRNA穿膜肽-反义肽核酸能够显着抑制铜绿假单胞菌PAO1生物被膜的形成。4.穿膜肽-反义肽核酸成功抑制铜绿假单胞菌PAO1的生长,并明显下调毒力因子弹性蛋白酶B基因及绿脓菌素和外毒素A的表达。5.本研究设计的穿膜肽-反义肽核酸可通过对铜绿假单胞菌las群体感应系统的淬灭,显着抑制铜绿假单胞菌PAO1的生长及毒力相关因子的表达,为铜绿假单胞菌感染的治疗提供新的思路。(本文来源于《第叁军医大学》期刊2017-04-01）
张峰领,安琳,李进,李发科,徐欢[2]（2017）在《铜绿假单胞菌lasR基因反义肽核酸序列筛选及其抑制生物被膜形成的研究》一文中研究指出目的筛选靶向铜绿假单胞菌lasR基因的反义肽核酸序列,探讨其对铜绿假单胞菌的生物被膜形成能力的影响。方法针对铜绿假单胞菌lasR基因设计4条反义寡核苷酸序列,利用斑点杂交筛选出与lasR基因结合最佳的反义寡核苷酸序列,以此合成与穿膜肽连接的肽-肽核酸序列。分别用不同浓度的肽-肽核酸导入铜绿假单胞菌生物被膜模式菌PAO1中,测定不同时相点细菌生长光密度[D(600)]值并进行菌落计数,观察肽-肽核酸对其生长的抑制作用。利用光学显微镜和扫描电镜观察生物被膜形成情况。q PCR方法检测lasR mRNA表达。结果斑点杂交实验结果显示:4条反义寡核苷酸序列中3条有杂交信号产生,其中第1条序列信号最强,以此为基础合成反义肽核酸。不同浓度的肽-肽核酸对铜绿假单胞菌表现出不同程度的体外抗菌活性,且随着浓度增加,抗菌活性增强。结论有效筛选出高效反义核苷酸序列,经筛选出的靶向铜绿假单胞菌lasR基因的反义肽核酸对铜绿假单胞菌的生长及生物被膜形成能力有明显抑制作用,同时抑制lasR mRNA的表达。(本文来源于《第叁军医大学学报》期刊2017年06期）
季军,潘一峰,何霞,令文萍,陈小玲[3]（2015）在《超声靶向转染c-myc基因的反义肽核酸抑制兔髂动脉平滑肌细胞增生的实验研究》一文中研究指出目的观察制备的白蛋白超声微泡载c-myc原癌基因反义寡肽核酸靶向转染血管内膜平滑肌细胞的效果及对受损血管内膜增生的影响。方法用球囊导管剥脱兔髂动脉内皮细胞制备血管内膜平滑肌细胞增生模型;设计合成针对兔c-myc m RNA原癌基因反义PNA,并将其5’-氨基端以生物素分子标记;采用白蛋白作为原料,在制备超声微泡过程中向白蛋白溶液中加入定量PNA制备白蛋白超声微泡-PNA靶向载体,在超声场的作用下转染局部血管壁细胞;用免疫组织化学法检测PNA转染效果并观察其对血管内膜平滑肌细胞表达增殖细胞核抗原的影响;血管形态测量法直接测量局部血管内膜厚度和面积并评价其对内膜增生的影响。结果超声波介导白蛋白超声微泡载c-myc反义PNA靶向转染受损血管壁获得成功并有效抑制血管内膜平滑肌细胞表达PCNA和内膜增生。结论白蛋白超声微泡携带PNA靶向转染方法为促进其进入体内特定细胞发挥功效提供又一可行途径。(本文来源于《中国现代医学杂志》期刊2015年02期）
韩静雅[4]（2014）在《脂质体介导~(99)Tc~m-EGFRmRNA反义肽核酸肿瘤显像的实验研究》一文中研究指出目的：研究脂质体介导放射性核素99Tcm标记的表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）mRNA反义肽核酸(peptidenucleic acid, PNA)的方法，测定该反义分子探针的标记率，评价其体内外稳定性，并探讨脂质体介导对99Tcm标记EGFR mRNA反义PNA体外靶细胞摄取、荷瘤裸鼠体内生物学分布及特异性显像的影响。探索促进99Tcm标记EGFR mRNA反义肽核酸分子探针进入靶细胞的方法，进一步提高该核素分子探针肿瘤基因显像的效果。方法：以EGFR mRNA（genbank序列号：NM_201283.1）的第503-519碱基序列（17bp）为靶序列，设计反义PNA5'-AATGAGGACATAACCAG-3'，于其5'端连接由Gly-(D)-Ala-Gly-Gly4个氨基酸形成并且能与99Tcm进行强力螯合的类似N4结构的短肽，最后在PNA与该结构之间引入可以消除空间阻碍的隔离物γ-氨基丁酸(4-aminobutyric acid, Aba)，完成反义PNA分子的合成。因PNA不带电荷，为了使反义PNA分子带负电荷以利于脂质体包裹，再合成与上述反义PNA3'末端8个碱基互补的短寡核苷酸链，即5′-CTGGTTAT-3′结构。利用碱基互补配对原则将带有短肽螯合功能的EGFR mRNA反义PNA与部分互补寡核苷酸杂交，使反义PNA分子带负电荷后进行99Tcm标记，标记后以脂质体包裹反义探针。用反相高效液相色谱法(reverse-phase highperformance liquid chromatography, RP-HPLC)鉴定脂质体介导及非介导的99Tcm标记EGFR mRNA反义PNA（99Tcm-EGFR-PNA）的标记率。并将两者于37℃条件下分别在生理盐水及人新鲜血清中孵育1、2、4、6、12、24h，用RT-HPLC测定各自在不同介质及不同时间点的放射化学纯度，以检测其体外稳定性。并采用静置贴壁法培养人卵巢癌SKOV3细胞及人乳腺癌MDA-MB-435S细胞，收集对数生长期细胞，按每只裸鼠1×1011/L的浓度接种0.2ml到无特异病原体级裸鼠右前肢外侧皮下，当瘤体直径约1cm时，选取肿瘤形态规则、色泽红润、大小无明显差异的荷瘤裸鼠用于实验。用RP-HPLC测定EGFR高表达的SKOV3细胞荷瘤裸鼠注射脂质体介导及非介导分子探针后2-3h时的尿液中分子探针的放化纯，以监测分子探针体内稳定性。研究脂质体介导与非介导的分子探针在EGFR高表达的SKOV3细胞及EGFR低表达的MDA-MB-435S细胞的摄取以及滞留情况，以了解探针的药代动力学。取32只SKOV3细胞荷瘤裸鼠，利用随机数字表法分为2组，每组16只。各组分别注射脂质体介导及非介导99Tcm-EGFR-PNA。取16只MDA-MB-435S细胞荷瘤裸鼠，尾静脉注射脂质体介导99Tcm-EGFR-PNA。在各组内按随机数字表法分别于注药后1、2、4、6h各取4只动物模型，眼静脉取血后，颈椎脱臼处死，取各脏器分别测定其放射性计数并称重，测定3个标准源的放射性计数，计算每克组织中放射性计数与标准源（3个标准源均值）的比值即%ID/g以及肿瘤与肌肉组织的%ID/g比值(tumor to muscle, T/M)。比较各时间点脂质体介导对分子探针在动物模型体内分布的影响。取10只SKOV3细胞荷瘤裸鼠，利用随机数字表法分为2组，每组5只。各组分别注射脂质体介导及非介导的99Tcm-EGFR-PNA。取5只MDA-MB-435S细胞荷瘤裸鼠，尾静脉注射脂质体介导99Tcm-EGFR-PNA。均于注药后1、2、4、6、8、10h行静态显像，观察各组内随时间变化肿瘤部位放射性浓聚的变化，利用感兴趣区技术测定肿瘤部位放射性计数与对侧正常部位同等区域放射性计数的比值（target to nontarget ratio, T/NT），并比较3组间显像的差异。所有实验数据均采用SAS9.1统计学软件进行统计学分析，实验数据以均数±标准差表示，对数据进行两样本t检验（或t'检验）或Wilcoxon秩和检验，以P<0.05为差异有统计学意义。结果：经RP-HPLC法检测，脂质体介导及非介导的99Tcm-EGFR-PNA放射及紫外峰几乎均为单峰，放射峰保留时间分别为19min、12.5min，6h内标记率分别为（95.17±0.55）%(n=6)、（98.75±1.09）%(n=6)，均较高，满足体内显像要求，无需进一步纯化。于37℃水浴条件下，在生理盐水及人新鲜血清中各孵育1、2、4、6、12和24h，6h内分子探针放射化学纯度均在90%以上，且放射峰位置较稳定，未见漂移。RP-HPLC鉴定注射了脂质体介导或非介导分子探针的荷瘤裸鼠的尿液，其放射峰出现时间点均以标记物走样时的保留时间点为主，主峰前出现一小代谢物峰，但并非游离99TcmO-4。尿液中脂质体介导及非介导的分子探针的放化纯分别为89.3%和90.0%。脂质体介导明显提高了EGFR高表达的SKOV3细胞对分子探针的摄取率（t′=47.11-58.67，Z=2.80，均P <0.05），最高可达8.8倍。加入脂质体后细胞对反义探针的摄取高峰时间由不加脂质体时的6h延迟至12h。EGFR高表达的SKOV3细胞对脂质体介导99Tcm-EGFR-PNA的细胞摄取率明显高于MDA-MB-435S细胞对其摄取率（t=20.54-30.16，t′=9.45，Z=2.80，均P﹤0.05）。脂质体介导后人卵巢癌SKOV3细胞对反义探针滞留率增加（t′=7.25-11.55，Z=2.80，均P<0.05）。体内生物分布实验显示，在EGFR高表达SKOV3细胞荷瘤模型组，探针主要分布在肿瘤、肝脏、肾脏，肿瘤组织放射性计数明显高于瘤体对侧肌肉组织的放射性计数，并且随时间延长，逐渐增加。脂质体介导可以明显提高不同时刻T/M值（t=11.24, t′=3.96-11.94,均P<0.05）。并且注射脂质体介导99Tcm-EGFR-PNA后SKOV3细胞荷瘤裸鼠各时间点的T/M值明显高于MDA-MB-435S细胞荷瘤裸鼠的T/M值（t=9.69，11.84，t′=6.2，6.23，均P<0.05）。体内显像实验显示，SKOV3细胞荷瘤裸鼠注射脂质体介导99Tcm-EGFR-PNA1h后肿瘤组织即有明显放射性核素浓聚，随时间延长浓聚程度增加，6h达摄取高峰，之后放射性核素浓聚程度轻度减低。SKOV3细胞荷瘤裸鼠非脂质体介导组，注药后1h肿瘤部位出现轻度摄取,6h达摄取高峰，之后放射性核素浓聚程度快速减低。并且脂质体介导可以明显增加各时间点T/NT值（t=3.96，t′=12.65-14.69，Z=2.83-5.29，均P<0.05）。MDA-MB-435S细胞荷瘤裸鼠注射脂质体介导99Tcm-EGFR-PNA后，在显像时间内肿瘤部位无明显放射性核素浓聚。结论：脂质体介导99Tcm-EGFR-PNA标记率高，体内外稳定性好，能够被EGFR高表达的细胞特异性摄取，可用于EGFR高表达肿瘤体内特异性显像。脂质体可以明显促进99Tcm-EGFR-PNA进入细胞，提高EGFR高表达肿瘤的显像效果，有助于肿瘤基因显像的诊断。(本文来源于《河北医科大学》期刊2014-03-01）
王慧娟,何云燕,夏云,王立朋,梁树梅[5]（2013）在《多重耐药鲍曼不动杆菌gyrA基因高效反义肽核酸序列筛选及其体外抗菌活性观察》一文中研究指出目的筛选出能与多重耐药鲍曼不动杆菌gyrA基因的mRNA紧密结合的反义肽核酸序列,评估其体外抗菌活性。方法利用Mfold、RNA Structure 4.6两种计算机软件对多重耐药鲍曼不动杆菌gyrA基因的mRNA进行二级结构分析计算,根据最低自由能原则在其mRNA局部杂交松弛区设计反义寡核苷酸,与体外转录的地高辛标记的gyrAmRNA进行斑点杂交,根据杂交信号的强弱筛选出与gyrA mRNA紧密结合的反义寡核苷酸,根据其序列合成肽核酸(pep-tide nucleic acid,PNA),另加设1条与靶序列有6个碱基错配的PNA作为阴性对照,2条PNA分别连接穿膜肽形成肽-肽核酸(peptide-PNA,PPNA)。测定经不同浓度PPNA处理的细菌光密度[D(600)]值并进行平板菌落计数,观察其对细菌生长的抑制作用,采用RT-PCR检测gyrA mRNA的表达水平。结果斑点杂交结果显示,计算机软件设计的10条反义寡核苷酸探针中有5条与gyrA mRNA显示出杂交信号,其中1条信号最强,能够与gyrA mRNA稳定结合,将其以肽-肽核酸的形式合成处理细菌,结果表明其在5μmol/L浓度可完全抑制gyrA mRNA的表达,并抑制鲍曼不动杆菌的生长,在10μmol/L浓度具有杀菌活性,而具有错配碱基的PPNA对细菌生长无明显抑制作用。结论计算机辅助设计联合斑点杂交可在体外模拟体内环境对寡核苷酸与靶基因结合的有效性进行验证,实现在体外高通量筛选高效反义序列。经筛选得到的靶向gyrA基因反义肽-肽核酸可在体外高效抑制多重耐药鲍曼不动杆菌生长。(本文来源于《第叁军医大学学报》期刊2013年14期）
王娜[6]（2013）在《~(99)Tc~m标记EGFR mRNA反义肽核酸荷瘤卵巢癌基因显像的研究》一文中研究指出目的：研究~(99)Tc~m标记表皮生长因子受体（Epidermal growth factorreceptor, EGFR) mRNA反义肽核酸(peptide nucleic acid, PNA)行EGFR基因分子探针的制备，测定其标记率及放化纯，评价其在体内外的稳定性，并探讨其在EGFR mRNA表达阳性卵巢癌荷瘤裸鼠体内分布及体内显像的情况，以探索核素基因显像在活体内评价肿瘤基因表达状况，为肿瘤早期特异诊断和靶向治疗及疗效评价提供新的分子影像学方法。方法：针对EGFR mRNA（genbank序列号：NM_201283.1）的第503-519碱基序列（17bp），设计反义PNA5′-AATGAGGACATAACCAG-3′及无义PNA5′-AGTAGAGATGTGACGAT-3′，将4个氨基酸(Gly-(D)-Ala-Gly-Gly)连接在其5′端，此四个氨基酸可形成一个类似N4结构的强螯合基团，在PNA与四个氨基酸之间再引入一个隔离物γ-氨基丁酸(4-amino-butyric acid，Aba)以消除空间障碍，然后用核素~(99)Tc~m进行标记。用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography, HPLC）测定两种探针的标记率及放化纯，并分别测定其在室温下静置、与生理盐水及人新鲜血清1:1混合置于37℃水浴箱中1、2、4、6、12、24h的放化纯以分析其在体外的稳定性；收集了注射~(99)Tc~m-EGFR mRNA反义及无义PNA探针荷瘤裸鼠30min及2-3h尿液，用HPLC测定其标记率以了解其在荷瘤裸鼠体内的稳定性。采用静置贴壁法培养人卵巢癌SKOV3细胞，收集对数生长期的人卵巢癌SKOV3细胞，调配成浓度为3x10~6个/ml加入到六孔板中，6×10~5个细胞/每孔（200μL/孔），然后置于培养箱中进行培养。待细胞长满至整个孔的80%-90%后，换新鲜培养基，然后加入30μL（37kBq）稀释好的反义或无义PNA溶液，再置于培养箱中分别培养1、2、4、6、12、24h后收集其上清及沉淀，测定其放射性计数，计算不同时间的摄取率并比较有无差异。将稀释好的30μL~(99)Tc~m-EGFR mRNA反义或无义PNA(37kBq)加入到SKOV3细胞的每个培养孔内（6×10~5个/孔），分别在培养箱内培养6h后，迅速移去培养基并换成新鲜培养基，再置于培养箱中继续培养至1、2、4、6、12、24小时收集每孔的上清及沉淀，并测定其放射性计数。计算不同时刻的细胞滞留率，初步探讨两种探针在人卵巢癌SKOV3细胞中的药代动力学。采用逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)测定人卵巢癌SKOV3细胞中EGFR mRNA的表达情况。收集对数生长期的人卵巢癌SKOV3细胞，调配成浓度为3.0×10~7个细胞/ml RPIM1640培养基（不含胎牛血清）的单细胞悬液，注射于裸鼠右前肢皮下，每只裸鼠注射体积为0.2ml（6×10~6个细胞）。待肿瘤长到1-1.5cm时，选取肿瘤形态规则，色泽红润，大小无显着性差异的荷瘤小鼠用于实验。对比分析了分子探针在荷人卵巢癌SKOV3裸鼠体内分布及基因显像情况,抽取荷人卵巢癌SKOV3裸鼠48只，随机分为反义及无义两组，每组24只，每组再分为1、2、4、6h四个亚组，每个亚组6只，分别经尾静脉注射~(99)Tc~m-EGFR mRNA反义或无义PNA探针0.1ml（1110kBq），分别于注射1、2、4、6h眼静脉采血后，断颈处死，取其心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺、胃、肠、脑、骨骼、肌肉及肿瘤等不同的组织或脏器，同时设置3个标准源，分别称重并测定不同时刻不同脏器的放射性计数及3个标准源放射性计数。计算每克组织中放射性计数占标准源总放射性计数（3个标准源的平均值）的比值(%ID/g)，比较两者间差异。再抽取荷人卵巢癌SKOV3裸鼠10只，随机分为反义及无义两组，每组5只，分别注射~(99)Tc~m标记的两种探针后，在1、2、4、6、8、10h进行静态显像，分别观察两组显像荷瘤裸鼠肿瘤放射性浓聚程度随时间变化的情况。计算不同时刻肿瘤部位放射性计数与对侧正常部位放射性计数比值(T/NT)。采用SAS9.1统计软件对实验数据进行统计学分析，所有实验结果的组间比较均采用两个样本的t检验，如果任何一组数据不符合正太性（p＜0.1）或者方差不齐（p＜0.1），则采取成组设计两样本比较的秩和检验，以p＜0.05表示差异有统计学意义。结果：在设定的HPLC条件下，~(99)Tc~m-EGFR mRNA反义或无义PNA呈单峰，保留时间为12.5min，其在室温下6h内标记率分别为98.80%±1.14%、98.63±1.36%（n=6），放化纯不低于95%；两种探针分别与生理盐水、人新鲜血清混合后6h，标记物的放化纯大于93%,甚至在混合后24h，其放化纯仍达到85%；收集注射了两种标记探针裸鼠的尿液后，经HPLC测定，注射了~(99)Tc~m标记反义探针后30min的尿液呈单峰，保留时间为12.5min，其注射后2-3h的尿液放化纯仍达到89%。人卵巢癌SKOV3细胞对~(99)Tc~m-EGFR mRNA反义及无义PNA的摄取率在1-6h随时间延长逐渐上升，随后逐渐下降，即6h细胞摄取率达到高峰，但~(99)Tc~m-EGFR mRNA反义PNA在各个时间点的细胞摄取率均高于~(99)Tc~m-EGFR mRNA无义PNA（P＜0.05）；而两种探针的细胞滞留率随时间延长均逐渐下降，~(99)Tc~m-EGFR mRNA无义PNA的细胞滞留率在1-24h内均低于~(99)Tc~m-EGFR mRNA反义PNA（P＜0.05）。RT-PCR结果表明，人卵巢癌SKOV3细胞中EGFR mRNA高表达。荷人卵巢癌SKOV3裸鼠体内分布结果显示~(99)Tc~m-EGFR mRNA反义或无义PNA在荷人卵巢癌SKOV3裸鼠体内的放射性分布除肿瘤外主要集中在肝脏和肾脏。尾静脉注射~(99)Tc~m-EGFR mRNA反义PNA后1-6h，肿瘤摄取随时间延长逐渐增高，明显高于肌肉组织，而注射~(99)Tc~m-EGFRmRNA无义PNA后1-6h，肿瘤摄取随时间延长逐渐降低；注射后任意时刻，肿瘤对~(99)Tc~m-EGFR mRNA反义PNA的摄取均高于~(99)Tc~m-EGFR mRNA无义PNA（P＜0.05）。荷瘤裸鼠体内基因显像结果显示，注射~(99)Tc~m-EGFR mRNA反义PNA后1h，肿瘤部位可见放射性核素浓聚，且在注射后1-6h，肿瘤放射性浓聚程度随时间延长越来越明显；而注射~(99)Tc~m-EGFR mRNA无义PNA的任一时刻，肿瘤部位均未见明显显影；反义组显像裸鼠的T/NT比值在显像的各个时间点均高于无义组（P＜0.05）。结论：~(99)Tc~m-EGFR mRNA反义PNA用四个氨基酸短肽作为螯合剂标记的分子探针其标记率及放化纯均较高，体内外稳定性好，用于体内显像能特异性的聚集在EGFR高表达的肿瘤组织中，可作为一种有潜力的核素分子探针用于EGFR mRNA基因表达阳性的卵巢癌等肿瘤显像诊断，并可评价肿瘤EGFR表达状况。(本文来源于《河北医科大学》期刊2013-03-01）
桑国军[7]（2012）在《以金黄色葡萄球菌RNA聚合酶σ~(70)因子为靶标的反义肽核酸的设计、合成及抗MRSA的活性研究》一文中研究指出目的金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus，SA）是一种重要致病菌，属葡萄球菌属，它广泛存在于自然界，可以引起多种感染，如皮肤感染、术后伤口感染、肺炎和败血症等。20世纪40年代青霉素问世以后，SA引起的感染得到了很好的控制，但是应用不久，某些菌株对青霉素产生耐药，随着青霉素的广泛应用，SA对青霉素的耐药情况越来越严重。1959年，人类又研制出耐青霉素酶的药物甲氧西林，应用临床后曾有效控制SA产青霉素酶菌株的感染。但是，1961英国首次发现了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)，此后，MRSA感染几乎遍及全球。目前，治疗MRSA最有效的药物是万古霉素，然而，1997年以来，世界各地发现了耐万古霉素MRSA临床菌株，因此，寻找一种新的有效控制MRSA感染的策略破在眉睫。为了有效对抗MRSA感染，必须寻找新的突破口。反义抗菌策略根据细菌体内基因组学相关信息，以细菌体内增殖、致病性、耐药相关基因为靶点，从阻断相关基因的表达入手，进而达到抑制或杀灭细菌的作用。一些研究已经证实反义抗菌剂在抑制细菌靶基因方面显示出很好的抗菌作用。由于反义抗菌剂的分子量较大，细胞摄入率低，本课题确定以下2个研究目标：（1）寻找抑制MRSA的有效靶基因；（2）研究促进反义分子进入细菌的递药策略。基于上述目标，我们以序列高度保守的金黄色葡萄球菌RNA聚合酶σ70因子的编码基因rpoD为靶点，设计并合成抗rpoD的肽核酸，将其与穿膜肽（CPP）共价连接制备成反义抗rpoD肽核酸（anti-rpoD PPNA），体外实验对其抗菌活性进行评价，证实anti-rpoD PPNA抗MRSA的有效性。方法1. anti-rpoD PNA的初步设计和合成在GENBANK中检索金黄色葡萄球菌rpoD基因的序列，应用BLAST软件将检索得到的rpoD基因在SA菌属间（包括耐药菌属）进行同源性分析。依据RNA structure4.6软件预测rpoD mRNA的二级结构，应用Oligowalk5.0和PNATm软件分析靶区域RNA与互补反义寡核苷酸结合的各项参数，综合多项参数确定抗rpoD的反义肽核酸序列，之后采用Fmoc方法在固相载体上自动合成抗rpoD反义PNA-CPP结合物（anti-rpoD PPNA）以及作为对照的PNA、穿膜肽（CPP）和错配序列PNA-CPP结合物（mismatched anti-rpoD PPNA），采用RP-HPLC对样品进行分离纯化，MALDI-TOF测定纯化后样品的分子量。2. anti-rpoD PPNA有效靶序列的筛选及优化用金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC29213、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌WHO-2、耐甲氧西林MRSA Mu50及西京医院检验科分离的临床多重耐药MRSA作为受试菌，以最低抑菌浓度（MIC）方法对anti-rpoD PPNA进行筛选，对抑菌效果最好的一条序列进行优化，包括改变CPP与PNA连接方向、在PNA与CPP间加入甘氨酸和减少核苷酸数量，然后再进行筛选。3．anti-rpoD PPNA抗MRSA体外活性研究我们用Mu50作为受试菌，采用测定细菌生长曲线、剂量依赖性杀菌效果，对筛选出的anti-rpoD PPNA进行体外抗菌活性评价；用RT-PCR及Western blot法检测最优anti-rpoD PPNA对Mu50rpoD基因的mRNA和蛋白质表达水平的影响，确定其反义抗菌作用的靶位特异性，揭示抗菌作用机制。4. anti-rpoD PPNA对Mu50感染人胃粘膜上皮细胞的保护作用将胃粘膜上皮细胞与Mu50菌株共孵育，建立细胞感染模型，加入不同剂量组anti-rpoD PPNA并设置错配序列对照组、CPP对照组及空白对照组，每2h测定细胞培养液中细菌数量，24h后在光学显微镜下观察细菌形态变化，研究其对感染细胞的保护作用。结果1. anti-rpoD PPNA的初步设计与合成同源性分析结果显示，SA菌属间rpoD基因同源性很高，说明rpoD基因高度保守，是反义抗菌的理想靶点。RNA structure4.6软件预测SA的rpoD基因mRNA的二级结构，选择膨胀环等不稳定部位作为可能的反义作用靶区域，计算其键能，同时，应用Oligo walk5.0和PNATm软件分析靶区域RNA与互补反义寡核苷酸结合的各项参数，挑选出综合参数评估较高的5条PNA序列。采用Fmoc方法合成反义PNA-CPP结合物以及作为对照的PNA、CPP和错配序列PNA-CPP结合物。2. anti-rpoD PPNA有效靶序列的筛选及优化采用最低抑菌浓度（MIC）方法对5条anti-rpoD PPNA进行筛选，得到序列起始位点在233的anti-rpoD PPNA抑菌效果最好，对ATCC29213、Mu50、WHO-2及xijing MRSA的MIC值最小，为了增强它的抑菌效果，我们对其进行优化，主要包括将CPP与PNA氮端相连接、在CPP与PNA间加入甘氨酸及减少核苷酸数量，然后MIC法对其抑菌效果进行测定，最终筛选出anti-rpoD PPNA2332为最优反义序列，它对四种菌株的MIC值均为12.5μM。3. anti-rpoD PPNA抗MRSA体外活性研究生长曲线实验和剂量依赖性杀菌效果实验结果显示，anti-rpoDPPNA2332具有很好的抗菌活性，与生长对照组相比，MIC（12.5μM）或高于MIC剂量的anti-rpoD PPNA2332可实现对Mu50的全程生长抑制，在剂量为40μM时，anti-rpoD PPNA2332显示出杀菌效果。RT-PCR及Westernblot结果显示，anti-rpoD PPNA2332作用后，Mu50的rpoD基因在mRNA和蛋白质水平的表达产物均受到了抑制，而且呈现出浓度依赖性。而内参16S rRNA基因的转录不受影响。4. anti-rpoD PPNA对Mu50感染人胃粘膜上皮细胞的保护作用光学显微镜照片显示，无菌对照组中，高浓度的anti-rpoD PPNA2332（10μM），对人胃粘膜上皮细胞生长没有明显影响，说明细胞毒性较小，而它在1μM时即可对导致细胞感染的细菌起到杀灭作用，保护细胞免受细菌感染所致的形态损伤和死亡。结论1.发现了一个新的抗MRSA的靶点，即编码细菌RNA聚合酶σ70因子的编码基因rpoD，确定了该基因序列第233至242共10个核酸序列为最优的反义PNA的靶序列。2.成功利用穿膜肽（KFF）3K与PNA共价连接的方式，将有效的反义PNA递送进入细菌内，并且体外实验证明anti-rpoD PPNA2332具有抗MRSA活性，对MRSA感染的真核细胞起到保护作用。(本文来源于《第四军医大学》期刊2012-04-01）
任秀春[8]（2012）在《~(99)Tc~m-EGFR mRNA反义肽核酸的制备及其在荷Lewis肺癌C57BL/6小鼠模型中的显像研究》一文中研究指出目的:研究99Tcm标记表皮生长因子受体(epidermal growth factorreceptor, EGFR) mRNA反义肽核酸(peptide nucleic acid, PNA)的制备方法，评价其标记条件及体外稳定性，并探讨该分子探针在荷Lewis肺癌C57BL/6小鼠体内显像的价值，研究反义基因显像早期、特异性诊断恶性肿瘤的可行性，为核素基因反义显像分子探针的制备及其早期诊断肿瘤提供实验依据。方法:以EGFR mRNA第251-267位寡核苷酸片段即5′-AGCAGCGATGCGACCCT-3′为靶序列，利用化学合成法人工合成EGFRmRNA反义PNA5′-AGGGTCGCATCGCTGCT-3′及无义PNA5′-AGTAGAGATGTGACGAT-3′。于反义/无义PNA5′端连接4个氨基酸(Gly-(D)-Ala-Gly-Gly-)的短肽结构，形成一个类似N4结构的强螯合基团，并引入1个γ-氨基丁酸(4-aminobutyric acid, Aba)作为隔离物消除空间阻碍，形成结构为Gly-(D)Ala-Gly-Gly-Aba-5′-AGGGTCGCATCGCTGCT-3′的化合物，利用配体交换法对反义PNA进行99Tcm标记。以相同的方法标记无义PNA，利用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)及快速薄层层析法(instant thin-layer chromatography, ITLC)测定标记物的即刻标记率，同时将标记物室温下放置4h、8h、12h以及24h后测定其体外稳定性；并将两种分子探针分别与人新鲜血清混合后37℃条件下静置24h，然后测定其在血清中的稳定性。复苏小鼠肺癌(Lewis)瘤株，接种于一只小鼠的右侧腋窝皮下，待移植肿瘤生长直径达2.0cm左右，处死荷瘤小鼠，将肿瘤组织切割成(3-4)mm3大小的组织块，制备成单细胞悬液，注射于小鼠右侧腋窝皮下，每只小鼠注射0.2ml，约4×106个细胞。定期观察小鼠的生存状态、饮食及肿瘤生长状况，当移植瘤体直径约1cm时，选取肿瘤形态规则，色泽红润，大小无显着性差异的荷瘤小鼠用于试验。利用逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)检测Lewis肺癌肿瘤组织中EGFR mRNA的表达情况。取10只荷瘤小鼠，随机平均分为反义显像组和无义显像组，分别经尾静脉注射标记率较高的99Tcm-EGFRmRNA反义/无义PNA0.1ml(含37MBq)，于注射后2h、6h、12h以及18h上机显像，观察两组间荷瘤小鼠移植瘤放射性浓聚的差异。采用SPSS16.0统计学软件对实验数据进行分析，所有计量资料结果均以x±s表示，两组间计量资料行独立样本t检验，多组间计量资料采用单因素方差分析，以p<0.05表示差异有统计学意义。结果:①经HPLC分析，在理想的标记条件下，99Tcm-EGFR mRNA反义PNA呈单峰，保留时间约为3.1min。经ITLC检测，标记物的即刻标记率可达(95.64±2.48)%(n=5)，室温下静置8h后标记率大于90%；标记物与新鲜血清孵育24h后标记率均仍>82%。99Tcm-EGFR mRNA反义PNA即刻标记率高，无需纯化，稳定性较好，可直接用于动物体内显像实验；②RT-PCR结果显示：在相应的位置可看到清晰的特异性条带，说明Lewis肺癌肿瘤组织高表达EGFR mRNA；③注射反义探针后2h移植瘤显影，肿瘤/对侧肢体放射性比值，即靶与非靶比值(target to nontarget ratios, T/NT比值)随时间推移而增加，12h以后两组T/NT比值(反义组12h：6.05±0.18，18h：7.06±0.18；无义组12h：1.29±0.12，18h：1.02±0.05)差异均有统计学意义(12h：t=53.392，P＜0.05；18h：t=76.657，P＜0.05)，其中18h时肿瘤显像最清晰。在显像早期，无义探针在移植瘤内有轻度浓聚，在6h以后肿瘤的浓聚程度下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论:99Tcm-EGFR mRNA反义PNA标记过程简便，生物学性能良好，即刻标记率高，无需纯化，可直接用于动物体内显像实验，并且能够在EGFR mRNA高表达的Lewis肺癌肿瘤组织内特异性聚集，较稳定地滞留在瘤体内，对肿瘤组织有良好的靶向作用，为肿瘤基因反义显像提供了较好的实验依据，有希望用于肿瘤的早期、特异性诊断。(本文来源于《河北医科大学》期刊2012-03-01）
赵新明,任秀春,戴萌,刘亚丽,张敬勉[9]（2011）在《~(99)Tc~m标记c-erbB-1 mRNA反义肽核酸及Lewis肺癌小鼠显像》一文中研究指出目的通过制备~(99)Tc~m标记的c-erbB-1 mRNA反义肽核酸(PNA)探针并进行Lewis肺癌小鼠显像,初步探讨该基因显像的可行性。方法化学合成c-erbB-1 mRNA的反义、无义PNA,在5′端连上4个氨基酸(Gly-(D)Ala-Gly-Gly),形成1个(本文来源于《中华医学会第九次全国核医学学术会议论文摘要汇编》期刊2011-08-24）
戴萌[10]（2011）在《~(99)Tc~m-survivin mRNA反义肽核酸在人肺癌A549荷瘤裸鼠体内分布及显像研究》一文中研究指出目的:通过制备~(99)Tc~m标记的survivin mRNA反义肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)探针,并进行人肺癌A549荷瘤裸鼠的体内分布及基因显像实验,观察反义探针在荷瘤裸鼠体内分布情况及在肿瘤组织部位的放射性聚集程度,探讨基因显像早期诊断肿瘤的可行性,为核素基因显像技术在肿瘤早期诊断方面进一步临床性研究提供实验室依据。方法:选用survivin mRNA的第240-251位寡核苷酸片段为靶序列,利用化学合成法合成与其互补的反义肽核酸片段5’-CCCAGCCTTCCA-3’,于5’端连上4个氨基酸组成的短肽结构(Gly-(D)-Ala-Gly-Gly-),形成1个类似N4结构的强螯合基团,为消除空间阻碍,引入1个γ-氨基丁酸(4-aminobutyric acid,Aba)作为隔离物,然后利用配体交换法进行~(99)Tc~m标记。以同样方法对无义肽核酸片段5’-TACCGTCTGCGA-3’进行~(99)Tc~m标记。采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)对标记物进行鉴定,测定标记物的保留时间及放射性化学纯度。以纯乙腈为展开剂,分别用聚酰胺凝胶膜和快速硅胶纸两种快速薄层层析法(instant thin-layer chromatography, ITLC)对标记物即刻标记率进行综合测定,并测定与人新鲜血清37℃保温24小时后的标记率,检测探针的体外稳定性。采用贴壁法培养人肺癌A549细胞,收获对数生长期的细胞,制备成1×107个/0.2ml生理盐水的单细胞悬液,接种到4周龄的雌性裸鼠的右前肢皮下,约14天后成瘤,待肿瘤直径长至1～1.5cm时,选取肿瘤形态规则,色泽红润,中心无坏死的荷瘤裸鼠纳入实验。利用Rt-PCR实验检测人肺癌A549细胞及肿瘤组织中survivin基因mRNA的表达情况。细胞摄取率及滞留率实验初步探讨反义肽核酸在肺癌A549细胞中的药代动力学作用。抽取30只荷瘤裸鼠,随机分为反、无义体内分布组,每组又分为1、2、4h叁个亚组,各5只,每只荷瘤裸鼠经尾静脉注射~(99)Tc~m标记的survivin mRNA反义或无义PNA (740kBq/0.1ml)后,分别于1、2、4h将对应各组荷瘤裸鼠眼静脉采血,处死并解剖各组织或脏器,分别测定血液、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、胃、肠道、脑、骨骼、肌肉及肿瘤等组织的重量及放射性计数,并测定相同时刻标准源的放射性计数,计算每克组织中放射性计数占标准源总放射性计数的比值(%ID/g),计算肿瘤组织与肌肉组织的%ID/g的比值(tumor to muscle ratios, T/M)。抽取A549荷瘤裸鼠10只,随机分为反、无义两组,各5只,每只荷瘤裸鼠经尾静脉注射~(99)Tc~m标记的survivin mRNA反义或无义PNA(37MBq/0.1ml)后,进行1、2、4h上机显像,观察两组间显像的差异。利用感兴趣区技术(region of interest,ROI)测得肿瘤组织与对侧正常组织的放射性计数的比值(target to nontarget ratio, T/NT)。所有计量资料均以x±s表示,采用SPSS13.0统计学软件对组间数据进行两个样本的成组t检验,P<0.05统计学差异有显着性。结果:~(99)Tc~m-survivin mRNA反义PNA经HPLC检测标记物呈单峰,保留时间约为12分钟,与survivin mRNA反义PNA的紫外峰保留时间基本一致。两种ITLC法综合检测~(99)Tc~m-survivin mRNA反义PNA即刻标记率为95.48%±1.92%(n=5),与人新鲜血清37℃保温24小时后标记率仍>85%。无义PNA即刻标记率及体外稳定性与反义PNA基本相同。Rt-PCR实验结果表明人肺癌A549细胞及肿瘤组织中均高表达survivin基因。细胞摄取实验结果显示A549细胞对两种肽核酸的摄取无明显统计学差异,肿瘤细胞与反义肽核酸在相互作用1h后有一个较稳定的平台期。3h内细胞对两种肽核酸都有一定的清除作用,无义组较反义组清除快,两组在60及120分钟时细胞滞留率差异有统计学意义。荷瘤裸鼠体内分布结果表明~(99)Tc~m-survivin mRNA反义PNA在肿瘤组织内分布明显高于肌肉组织。此外,肾脏和肝脏中的放射性分布最高。反义组1、2、4h肿瘤组织的%ID/g分别为2.51±1.20、1.52±0.16、1.35±0.27。计算反义、无义两组各时刻T/M值,组间结果显示4h时差异有统计学意义(t=2.506, p=0.041)。反义基因显像显示~(99)Tc~m -survivin mRNA反义PNA在肿瘤部位特异性聚集,随着时间的延长,聚集程度也相对逐渐增加,4h时肿瘤组织部位显像最清晰。利用ROI技术测得的1、2、4h小时T/NT值分别为2.70±0.28、3.44±0.35、4.21±0.63。此外荷瘤裸鼠腹腔有一定的放射性聚集。无义PNA在肿瘤部位中仅稍有放射性核素聚集,显像过程中聚集程度变化不明显。4h时反义、无义两组间T/NT值差异有统计学意义(t=2.918, p=0.019),与体内分布中T/M比值结果相吻合。结论:~(99)Tc~m-survivin mRNA反义PNA即刻标记率高,体外稳定性好,无需纯化即可用于动物模型中体内显像,可被高表达survivin基因的人肺癌A549细胞特异性摄取,荷瘤裸鼠反义基因显像结果达到了预期的实验目的,反义肽核酸在肿瘤组织内特异性聚集,与体内分布结果一致,显示了放射性核素基因显像技术早期、特异性诊断肿瘤的可行性,为肿瘤核素基因显像技术进一步临床性研究提供实验室依据。(本文来源于《河北医科大学》期刊2011-03-01）
反义肽核酸论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的筛选靶向铜绿假单胞菌lasR基因的反义肽核酸序列,探讨其对铜绿假单胞菌的生物被膜形成能力的影响。方法针对铜绿假单胞菌lasR基因设计4条反义寡核苷酸序列,利用斑点杂交筛选出与lasR基因结合最佳的反义寡核苷酸序列,以此合成与穿膜肽连接的肽-肽核酸序列。分别用不同浓度的肽-肽核酸导入铜绿假单胞菌生物被膜模式菌PAO1中,测定不同时相点细菌生长光密度[D(600)]值并进行菌落计数,观察肽-肽核酸对其生长的抑制作用。利用光学显微镜和扫描电镜观察生物被膜形成情况。q PCR方法检测lasR mRNA表达。结果斑点杂交实验结果显示:4条反义寡核苷酸序列中3条有杂交信号产生,其中第1条序列信号最强,以此为基础合成反义肽核酸。不同浓度的肽-肽核酸对铜绿假单胞菌表现出不同程度的体外抗菌活性,且随着浓度增加,抗菌活性增强。结论有效筛选出高效反义核苷酸序列,经筛选出的靶向铜绿假单胞菌lasR基因的反义肽核酸对铜绿假单胞菌的生长及生物被膜形成能力有明显抑制作用,同时抑制lasR mRNA的表达。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
反义肽核酸论文参考文献
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