（1.陕西中医学院第二附属医院陕西咸阳712000；2.陕西省中医医院陕西西安710003）
（3.咸阳职业技术学院陕西咸阳712000）
【摘要】目的：观察肾复康Ⅱ号联合骨髓间充质干细胞(MSCs)移植对肾间质纤维化模型大鼠肾功能、肾脏保护性生长因子的影响。方法：采用密度梯度离心法体外分离培养大鼠MSCs。将30只健康SD大鼠随机分为模型组、肾复康Ⅱ号联合移植组与单纯移植组,分别灌服肾复康Ⅱ号水溶液(405mg/kg·d)和等体积生理盐水,每日1次,连续14天。结扎左侧输尿管，制备输尿管结扎模型。将MSCs以尾静脉注射的方法进行移植。分别于移植后1周，2周，4周检测大鼠肾功能，并于大鼠处死后检测肾组织中肾脏保护性生长因子水平。结果：肾复康Ⅱ号联合移植组与单纯移植组大鼠肾功能均有所改善,而肾复康Ⅱ号联合移植组改善更明显。其肾组织中肾脏保护性生长因子HGF较单纯移植组明显增加。结论：肾复康Ⅱ号联合MSCs移植能改善肾间质纤维化模型大鼠的肾功能,增加肾脏保护性生长因子的分泌,与MSCs单纯移植组比较疗效更显著。
【关键词】肾复康Ⅱ号；骨髓间充质干细胞；肾功能；肾脏保护性生长因子
【中图分类号】R692.3【文献标识码】A【文章编号】1004-6194（2015）02-0006-02
【Abstract】ObjectiveToobservetheeffectofmarrowmesenchymalstemcells(MSCs)transplantationcombinedwithShenfukangⅡandsimpleMSCstransplantationonkindeyfunctionandrenalprotectivegrowthfactorinrenalinterstitialfibrosisrats.MethodRatMSCswereisolatedbydensitygradientmethod.30SDratswerepidedintothreegroupsrandomly,modelsgroup,transplantationcombinedwithShenfukangⅡgroupandsimpletransplantationgroup.ThesuspensionofShenfukangⅡ(405mg/kg·d)andNSwereadministeredtoSDratsbygastrogavagerespectivelyfor14days.Theleftureterofratwasligatedtoestablishanimalmodelsofrenalinterstitialfibrosisrats.TheMSCswereimplantedbycaudalveinintothekidneytissure.After1w，2w，4w,thekidneyfunctionweredetectedbyserumoftherats.After4weeks,renalprotectivegrowthfactorofkidneytissurewasdetectedbyELISA.ResultsKindeyfunctionwereimprovedinbothgroups,andwasmoresignificantinMSCstransplantationcombinedwithShenfukangⅡgroup.RenalprotectivegrowthfactorofkidneytissurewasincreasedintransplantationcombinedwithShenfukangⅡgroupthansimpletransplantationgroup.ConclusionMSCstransplantationcombinedwithShenfukangⅡcouldimprovekidneyfunctionofrenalinterstitialfibrosisrats,increaserenalprotectivegrowthfactorofkidneytissure,thetherapeuticeffectweremoresignificantthansimpleMSCstransplantation.
【Keywords】ShenfukangⅡ；marrowmesenchymalstemcells；kidneyfunction；renalinterstitialfibrosisrats
前期研究表明,益肾散结复方肾复康Ⅱ号含药血清具有体外促进MSCs分泌肾脏保护性生长因子HGF、BMP-7的作用[1]。本实验旨在探讨肾复康Ⅱ号协同MSCs移植对肾间质纤维化模型大鼠肾功能、肾脏保护性生长因子的影响。
1实验材料
1.1动物
1周龄SD大鼠3只(制备MSCs用),雄性,体质量(25±5)g；健康成年SD大鼠30只,雄性,体质量(250±20)g,中国人民解放军第四军医大学动物中心提供。
1.2药物
肾复康Ⅱ号水溶液（山萸肉12g、菟丝子12g、金樱子10g、淫羊藿10g、炒杜仲10g、丹参12g、姜黄10g、莪术10g、赤芍10g、王不留行12g、鳖甲12g、僵蚕12g），陕西省中医医院药剂科提供。
1.3主要仪器与试剂
二氧化碳孵箱(HERAcell),percoll分离液(pharmacia公司),F12-DMEM培养基、进口胎牛血清(JIBCO公司),尿素氮、肌酐检测试剂盒（上海聚创生物科技有限公司）,ELISA试剂盒(武汉博士德生物技术公司)。
2实验方法
2.1分组
成年SD大鼠30只分为模型组、肾复康Ⅱ号联合移植组、单纯移植组,造模前分别灌服等体积肾复康Ⅱ号水溶液(405mg/kg·d)及生理盐水14天。
2.2骨髓间充质干细胞的分离、纯化和培养
将3只1周龄SD大鼠断颈处死,浸泡在75%乙醇中5min,置于超净台中；在超净台中无菌取下股骨、胫骨置于平皿中,剪断股骨、胫骨两端骨骺露出骨髓腔，吸引无血清的培养基，反复数次冲出骨髓组织，1000r/min，离心10min。弃上清；在细胞沉淀中加入含10%FBS，1%青、链霉素的L-DMEM培养基，充分吹打制成单细胞悬液，以1×106/cm2的密度接种于25cm2的塑料培养瓶，37℃、5%饱和湿度的CO2孵箱培养。5d后换液，传代。
2.3造模
3组大鼠于第15日,10%水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔麻醉，行左侧背部肋下约0.5cm处切口，纵向逐层切开皮肤、肌层至腹腔，游离左侧肾脏及输尿管，以4-0无损伤线两次结扎左侧输尿管，从中间剪断输尿管，制备输尿管结扎模型。
2.4骨髓间充质干细胞移植
3组大鼠于输尿管结扎术后1ｈ,尾静脉移植MSCs(5×106个细胞/100μL)。
2.5大鼠肾功能检测
分别于移植后1周、2周、4周，10%水合氯醛0.3ml腹腔注射麻醉后，股动脉取血3ml，用尿素氮、肌酐试剂盒检测大鼠尿素氮、肌酐水平，具体操作同试剂盒说明。
2.6肾脏保护性生长因子的检测
4周后，股静脉注射10%KCl处死大鼠，迅速分离肾脏，以右肾为对照。将肾组织匀浆后备用。加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测匀浆液样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。轻轻振荡混匀，37℃温育1h。甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后立即测定结果。在560nm波长处测定各孔的OD值。
2.7统计学方法
采用SPSS14.0医学统计软件包进行统计学处理。以P<0.05表示有统计学意义。
3结果
3.13组大鼠肾功能改变：移植组大鼠肾功能均有所改善，而肾复康Ⅱ号组促进移植MSCs改善作用更明显。
4讨论
近年来研究发现，通过将MSCs导入慢性肾脏病肾组织的微环境中,可以促进MSCs分泌抗纤维化因子抑制肾间质纤维化，从而为慢性肾脏病的治疗带来了新的希望[2,3]。多数观点认为，MSCs归巢至受损组织以旁分泌方式起作用抑制肾间质纤维化是发挥治疗作用的主要机制[4]。但由于MSCs在体内损伤微环境中的旁分泌能力有限，因此，是否存在一种方法可以提高MSCs的旁分泌功能，抑制肾组织的纤维化呢？本实验旨在观察和探讨应用肾复康Ⅱ号联合MSCs移植可否改善肾间质纤维化模型大鼠肾功能，促进肾脏保护性生长因子分泌。研究结果发现：经MSCs移植后4周，肾间质纤维化大鼠的肾功能明显改善，而肾复康Ⅱ号联合移植组肾功能改善更为明显,且联合移植组肾脏保护性生长因子较单纯移植组明显增加。表明肾复康Ⅱ号具有协助MSCs移植治疗肾间质纤维化、促进肾脏保护性生长因子分泌的作用,可望为临床协助MSCs移植增加疗效提供一种安全、有效的治疗手段。
参考文献：
[1]张晓凤,樊平,田耘.肾复康Ⅱ号胶囊含药血清对骨髓间充质干细胞分泌肾脏保护性生长因子的作用.陕西中医.2015.(02):251-252.
[2]刘玉园,刘虹.干细胞在肾间质纤维化中的探究进展.中国中西医结合肾病杂志.2013.(05):464-466.
[3]曹星宇,肖践明.骨髓间充质干细胞归巢进展.临床医学.2013.(03):111-114.
[4]ChengK,RaiP,PlagovA,etal.Transplantationofbonemarrow-derivedMSCsimprovescisplatinum-inducedrenalinjurythroughparacrinemechanisms[J].ExpMolPathol,2013,94(3):466-473.
作者简介：
付小燕（1974年—），女，主治医师，硕士研究生毕业，从事医学临床及教学工作。
基金项目：
陕西省自然科学基础研究计划资助（2015JQ8294）