检测禽网状内皮组织增生症病毒抗体的ELISA方法的建立及其初步应用

论文摘要

禽网状内皮组织增生症是禽类的一种重要的致瘤性和免疫抑制性疾病,由反转录病毒科的禽网状内皮增生症病毒（Reticuloendotheliosisvirus,REV）引起的鸡、鸭、鹅及其他禽类发生的病理综合征,感染禽可引发肿瘤、生长矮小综合征、腺胃炎、急性网状细胞肿瘤、淋巴组织与其他组织慢性肿瘤形成等,特别要注意的是其感染胸腺和腔上囊等主要免疫器官,引起免疫组织器官萎缩,降低家禽的免疫能力,导致免疫抑制,从而为病毒和细菌的继发感染提供了便利,是继马立克氏病病毒（Marek’s disease virus,MDV）、禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）之后的第三种禽病毒性肿瘤病,是近几年危害严重的鸡病之一。随着养禽业的迅速发展,免疫抑制病越来越受到人们的重视,尤其是REV已经给我国养禽业带来重大经济损失,迫切需要REV感染的快速诊断方法。目前虽然国外有检测REV抗体的试剂盒,但国内相关产品缺乏,且国外进口试剂盒价格昂贵,在鸡场进行大批量检测成本很高,不能满足实际需求,亟需研发一种简便快速,特异性强,物美价廉,适合我国养禽生产实际的方法和试剂盒。1.以合成肽为抗原检测REV抗体的ELISA方法的建立本研究通过生物信息学原理,应用计算机软件DNA Star对REV囊膜蛋白gp90氨基酸的二级结构、可及性、亲水性、可塑性等进行综合分析,选取四段多肽序列（REV-gp90-p1/p2/p3/p4）进行抗原多肽合成,通过间接ELISA方法,用已知REV多抗血清进行了鉴定,结果显示所有多肽均能与REV多抗血清反应,但反应性有所差异,仅REV-gp90-p4与REV抗体阳性的血清反应性较好。结合本实验室制备的针对REVgp90的单克隆抗体表位分析结果,选取了 REV-gp90-p4和单抗表位多肽两段不相邻的序列,连接后（REV-gp90-p5）进行抗原多肽合成,用已知REV多抗血清进行了鉴定,结果显示REV-gp90-p5能与REV多抗血清反应,并且反应效果比REV-gp90-p4更好。随后我们比较了多肽REV-gp90-p5裸肽和多肽偶联KLH后与多抗血清的反应性,结果发现,多肽裸肽作为抗原检测REV抗体非特异更低,检测效果更好,所以本研究最后选择REV-gp90-p5多肽作为抗原包被酶标板,用于建立检测REV抗体的ELISA方法。将上述筛选出的最佳多肽REV-gp90-p5作为包被抗原,通过控制单一变量法确定最佳ELISA条件,包括抗原多肽最佳包被浓度、最佳封闭液的选择及封闭时间的确定、一抗最佳稀释倍数、一抗最佳孵育时间、HRP标记的兔抗鸡IgG最佳孵育时间及TMB底物显色液最适显色时间等,最后确定了最佳ELISA条件。特异性试验研究结果表明本研究建立的多肽ELISA方法仅与REV多抗血清反应,而不与抗其它禽类病毒（ALV-A、ALV-J、CAV、MDV、NDV）的多抗血清反应,说明本方法有很好的特异性。应用上述条件组建ELISA抗体检测试剂盒,结果批间和批内的变异系数均小于10%,说明该检测方法重复性、稳定性良好,具有实际应用开发价值。2.检测REV抗体的多肽ELISA试剂盒初步应用将上述建立的ELISA检测方法和组建的试剂盒,对实验室人工感染REV后不同周龄鸡血清进行检测,同时进行间接免疫荧光试验（IFA）,比较检测结果。结果38份血清样品,多肽ELISA检测可以出10份阳性样品,IFA可以检测出15份阳性样品,其中包括ELISA检测为阳性的10份样品。用本研究建立的ELISA方法对江苏省某鸡场送检的血清样本进行检测,结果发现,160份随机样品中可以检测出154份阳性。为进一步确认检测结果的准确性,用IDEXX公司检测REV抗体的ELISA试剂盒和IFA方法分别对检测出的同批样品再次进行检测验证,结果显示160份样本中IFA能检测出132份阳性,而IDEXX公司的ELISA抗体检测试剂盒只能检测出14份。综上结果表明,本研究建立的间接ELISA方法较商品化试剂盒具有更高的特异性和灵敏性,从而为我国禽网状内皮组织增殖症的诊断奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 符号说明
• 综述
•   1. 禽网状内皮组织增生症概述
•     1.1 病毒及毒株分类分类
•     1.2 病毒的基因结构及功能
•     1.3 病毒形态结构和理化特性
•     1.4 流行病学特性
•     1.5 临床表现与组织病理学变化
•     1.6 诊断方法研究进展
•   2. 多肽固相合成进展
•     2.1 概况
•     2.2 多肽合成原理和方法
•     2.3 应用
•     2.4 发展前景
•   3. 抗原表位鉴定研究进展
•     3.1 亲水性（Hydrophilicity）
•     3.2 可塑性（Flexibility）
•     3.3 可及性（Accessibility）
•     3.4 二级结构（Secondary structure）
•     3.5 电荷分布（Charge distribution）
•     3.6 长度（length）
•   4. 本研究的目的与意义
• 研究内容一 以合成肽为抗原建立检测REV抗体的ELISA方法
•   1. 材料
•     1.1 生物材料
•     1.2 主要材料试剂
•     1.3 主要仪器
•     1.4 主要溶液配制
•   2. 方法
•     2.1 计算机软件分析
•     2.2 最佳多肽的确定
•     2.3 间接ELISA的建立及条件的优化
•     2.4 特异性试验
•     2.5 批间及批内重复性试验
•   3. 结果与分析
•     3.1 多肽序列筛选结果
•     3.2 合成肽抗原性的初步鉴定
•     3.3 多肽偶联对ELISA反应效果影响
•     3.4 间接ELISA方法的建立及优化
•     3.5 ELISA方法结果判定标准的确定
•     3.6 特异性试验
•     3.7 批间及批内重复性试验
•   4. 讨论
• 研究内容二 REV多肽ELISA抗体检测方法的初步应用
•   1. 材料
•     1.1 生物材料与试剂
•     1.2 主要仪器
•   2. 方法
•     2.1 多肽ELISA抗体检测方法
•     2.2 IDEXX REV抗体检测试剂盒检测程序
•     2.3 IFA检测人工攻毒REV后不同周龄鸡血清程序
•   3. 结果
•     3.1 多肽ELISA方法对REV人工感染鸡血清的检测效果
•     3.2 多肽ELISA方法检测随机临床样品的结果
•     3.3 多肽ELISA与商品化试剂盒检测结果的比较
•     3.4 IFA试验对ELISA结果的验证分析
•   4. 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 杨叶

导师: 秦爱建,刘岳龙

关键词: 禽网状内皮组织增殖症,抗原表位,多肽抗原,间接,试剂盒比较

来源: 扬州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 扬州大学

基金: 国家重点研发计划项目(2016YFD0500803),国家科技基础性工作专项(2013FY113300-4),江苏省优势学科项目,江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心项目

分类号: S852.65

DOI: 10.27441/d.cnki.gyzdu.2019.000251

总页数: 55

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