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植物乳杆菌p-8羟基脂肪酸脱氢酶的原核异源表达与生物信息学分析及其酶学性质研究

2020-12-02阅读(481)

植物乳杆菌p-8羟基脂肪酸脱氢酶的原核异源表达与生物信息学分析及其酶学性质研究

论文摘要

共轭亚油酸（Conjugated linoleic acid,CLA）是具有共轭双键的十八碳二烯酸,具有抗癌、抗动脉粥样硬化和降脂等生理功效。植物乳杆菌可以转化亚油酸（Linoleic acid,LA）生成CLA,此过程需要脂肪酸水合酶（Fatty acid hydratase,CLA-HY）、羟基脂肪酸脱氢酶（Hydroxy fatty acid dehydrogenase,CLA-DH）和乙酰乙酸脱羧酶（Acetoacetate decarboxylase,CLA-DC）共同参与。所以,CLA-DH 是酶法生产 CLA的瓶颈之一。本实验对植物乳杆菌p-8的CLA-DH进行了基因克隆、原核表达、生物信息学分析和酶学性质研究,得到以下结果:（1）以植物乳杆菌p-8的基因组为模板扩增出CLA-DH,构建pET-28a-CLA-DH,转化入E.col Trans1-T1,经菌落PCR、酶切和序列分析说明原核表达载体构建成功。（2）通过对CLA-DH的生物信息学分析发现,CLA-DH为同亚基六聚体,属于典型的SDR超家族成员,具有Rossman折叠的典型保守结构,其N端存在辅酶结合位点的特征序列G-x-x-x-G-x-G,在140～160位氨基酸残基之间存在保守的催化活性位点的特征序列S-xn-Y-x-x-x-K。CLA-DH含286个氨基酸,是稳定的水溶性的胞质蛋白,无跨膜区和信号肽。其分子质量为32.0918 kDa,等电点为5.15,不稳定指数为25.53,平均亲水性（GRAVY）为-0.179。（3）将pET-28a-CLA-DH转化入E.coli Transetta（DE3）,经IPTG诱导表达,Western Blot证明重组酶CLA-DH成功表达。（4）为提高可溶性CLA-DH的表达量,研究了诱导温度、诱导剂浓度和诱导时间对可溶性CLA-DH的表达量的影响,结果表明在诱导温度为16℃,IPTG终浓度为0.5 mmol/L,诱导时间为12 h的条件下可溶性CLA-DH的表达量最高。（5）对CLA-DH进行纯化浓缩,得到电泳均一性和含量较高的CLA-DH。以蓖麻油酸为底物对其酶学性质进行研究,发现CLA-DH最适温度为45℃,在20℃能保持一定的稳定性。最适pH为6～7,在此范围内稳定性较好。Mg2+、Mn2+、Fe3+可以提高酶活力,Cu2+、Zn2+、Fe2+会抑制酶活力,Vmax是1.04μmol/L·min,Km值是6.72 mmol/L,kcat 值是 3.3 6 min-1。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 缩略语表
  • 1 引言
  •   1.1 共轭亚油酸
  •     1.1.1 共轭亚油酸的功能
  •     1.1.2 共轭亚油酸的合成
  •   1.2 植物乳杆菌转化共轭亚油酸的机制
  •   1.3 植物乳杆菌p-8
  •   1.4 SDR超家族
  •   1.5 酶与生物信息学的关系
  •   1.6 研究意义与内容
  • 2 材料与方法
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 菌株
  •     2.1.2 载体
  •     2.1.3 引物
  •     2.1.4 培养基
  •     2.1.5 工具酶
  •     2.1.6 试剂盒
  •     2.1.7 生化试剂
  •     2.1.8 缓冲液和溶液配制
  •     2.1.9 主要仪器设备
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 构建原核表达载体
  •     2.2.2 CLA-DH的生物信息学分析
  •     2.2.3 诱导表达
  •     2.2.4 大量制备CLA-DH粗酶液
  •     2.2.5 气相色谱法鉴定CLA-DH的活性
  •     2.2.6 纯化与浓缩
  •     2.2.7 检测蛋白含量
  •     2.2.8 CLA-DH的活力测定
  •     2.2.9 CLA-DH的酶学性质研究
  • 3 结果与分析
  •   3.1 表达载体的构建
  •     3.1.1 植物乳杆菌p-8全基因组的提取
  •     3.1.2 CLA-DH基因的扩增
  •     3.1.3 重组菌T1-pET-28a-CLA-DH菌落PCR鉴定
  •     3.1.4 重组质粒pET-28a-CLA-DH双酶切鉴定
  •     3.1.5 重组菌测序
  •   3.2 CLA-DH的生物信息学分析
  •     3.2.1 CLA-DH序列比对分析
  •     3.2.2 蛋白质理化性质分析
  •     3.2.3 蛋白质亲疏水性分析
  •     3.2.4 跨膜结构域分析
  •     3.2.5 信号肽预测
  •     3.2.6 蛋白质亚细胞定位预测
  •     3.2.7 磷酸化位点分析
  •     3.2.8 蛋白质二级结构预测分析
  •     3.2.9 蛋白质三维结构预测分析
  •   3.3 CLA-DH的诱导表达
  •     3.3.1 CLA-DH的诱导表达与鉴定
  •     3.3.2 可溶性CLA-DH表达最佳诱导条件的确定
  •   3.4 气相色谱法鉴定CLA-DH的活性
  •   3.5 CLA-DH的纯化与浓缩
  •   3.6 CLA-DH的含量和活力分析
  •     3.6.1 蛋白质含量标准曲线
  •     3.6.2 NADH标准曲线
  •     3.6.3 CLA-DH的蛋白含量及活力测定
  •   3.7 CLA-DH酶学性质的分析
  •     3.7.1 CLA-DH最适温度的确定
  •     3.7.2 CLA-DH的温度稳定性分析
  •     3.7.3 CLA-DH最适pH的确定
  •     3.7.4 CLA-DH pH稳定性的分析
  •     3.7.5 金属离子对CLA-DH的影响
  •     3.7.6 CLA-DH的动力学参数分析
  • 4 讨论
  •   4.1 CLA-DH的基因克隆和表达
  •   4.2 CLA-DH的活力分析
  •   4.3 CLA-DH的结构分析
  • 5 结论
  • 致谢
  • 参考文献
  • 作者简介

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 赵彤彤

    导师: 赵国芬

    关键词: 共轭亚油酸,植物乳杆菌,羟基脂肪酸脱氢酶,超家族

    来源: 内蒙古农业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 内蒙古农业大学

    基金: 国家自然科学基金(31560443),内蒙古自然科学基金(2017MS0306)

    分类号: Q93

    DOI: 10.27229/d.cnki.gnmnu.2019.000490

    总页数: 70

    文件大小: 5305K

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