牛单纯疱疹病毒Ⅰ型gB基因原核表达载体的构建及蛋白表达

论文摘要

目的:获取牛单纯疱疹病毒Ⅰ型gB基因编码的蛋白。方法:根据GenBank中牛疱疹病毒Ⅰ型VRL27-FEB-2012株囊膜糖蛋白B（UL27）基因,设计并合成一对特异性引物,利用PCR方法扩增gB基因序列的第100～1197bp,将此目的片段其命名为1F8基因,随后将PCR扩增后的1F8基因克隆到pMD18-T载体上,重组质粒命名为pMD18-T-1F8;对构建的重组克隆质粒进行PCR、双酶切和测序鉴定正确后,将目的基因亚克隆到pET-32a（+）原核表达载体上,并转化到BL21感受态细胞中,获得的重组表达质粒pET-32a（+）-1F8,再通过双酶切和测序进行鉴定;鉴定正确后,在37℃条件下用终浓度为0.1mM IPTG诱导重组菌4h,取诱导后产物进行SDS-PAGE分析和Western Blot鉴定。结果:通过琼脂糖凝胶电泳实验结果表明,在1097bp处出现了目的条带;对pMD18-T-1F8重组质粒的PCR、酶切及测序结果表明,扩增的目的条带为牛疱疹病毒Ⅰ型gB基因序列;通过SDS-PAGE和Western Blot实验对表达蛋白的鉴定结果显示,在58.6kDa左右出现目的条带,与软件预测蛋白的大小相符,确定为牛疱疹病毒Ⅰ型gB蛋白。结论:研究成功构建了牛单纯疱疹病毒Ⅰ型gB基因部分片段1F8的重组表达质粒pET-32a（+）-1F8,并成功表达1F8蛋白,为后续牛单纯疱疹病毒Ⅰ型单克隆抗体的制备和检测方法的建立奠定了基础。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 材料
•     1.1.1 病毒
•     1.1.2 细胞与菌株
•     1.1.3 实验动物
•     1.1.4 主要试剂
•   1.2 方法
•     1.2.1 引物设计与合成
•     1.2.2 PCR扩增
•     1.2.3 目的基因的克隆
•     1.2.4 目的基因原核表达载体的构建
•     1.2.5 重组蛋白的诱导表达
•     1.2.6 重组蛋白的纯化
•     1.2.7 重组蛋白Western Blot鉴定
• 2 结果与分析
•   2.1 1F8基因PCR扩增
•   2.2 重组表达质粒PCR和双酶切鉴定结果
•   2.3 重组蛋白SDS-PAGE电泳结果
•   2.4 重组蛋白的纯化
•   2.5 重组蛋白Western Blot检测
• 3 结论与讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 张海威,翟璐,王丽姿,黄艳梅,涂伟,徐乐,宋佰芬

关键词: 牛单纯疱疹病毒型,基因,原核表达

来源: 安徽农学通报 2019年04期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院

基金: 科技部十三五重点研发项目,课题名称:牛羊常见病毒病的诊断与检测新技术研究课题编号:2016YFD0500904

分类号: S852.65

DOI: 10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2019.04.004

页码: 8-11+31

总页数: 5

文件大小: 1555K

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