嵌合猫杯状病毒F9株反向遗传系统的建立及复制差异基因的筛选

论文摘要

猫杯状病毒（FCV）属于杯状病毒科水疮性病毒属,主要危害猫科类动物,呈世界范围分布。猫杯状病毒主要引起上呼吸道类疾病,严重威胁家猫等猫科动物的生存。疫苗免疫是保护动物免受病毒危害的主要手段,但目前FCV疫苗提供的免疫保护较差,家猫免疫后仍可能患上猫杯状病毒病,患病动物将长期甚至终身排毒。目前国内尚无已批准销售的猫杯状病毒国产疫苗。因此猫杯状病毒的研究十分迫切,目前相关的研究仍然有限,我们对于猫杯状病毒各方面的了解尚显不足。弱毒株FCV F9是经典的猫杯状病毒疫苗株,也是目前大多数FCV活疫苗的亲本株,普遍被用于猫杯状病毒疫苗方面的研究。为构建FCV F9感染性克隆,本研究利用酶切连接的方式拼接了FCV F9全基因组序列。通过优化序列的密码子解决了移码突变问题,获得氨基酸完全相同的重组FCV F9克隆质粒pOK-F9H。将线性化的pOK-F9H进行体外转录,获得加帽RNA转染F81细胞,拯救得到病毒rFCV F9。经过对拯救病毒与亲本株的噬斑形成能力、CPE形成能力和多步生长曲线分析,结果表明,rFCV F9与亲本株在复制能力和体外生长能力方面基本一致,表明成功构建了弱毒株FCV F9株的感染性克隆并拯救出病毒。本实验室前期已构建强毒株FCV 2280的反向遗传系统,下一步利用强弱毒的两个反向遗传系统构建嵌合病毒进行实验。我们通过构建ORFs嵌合病毒的方式,研究猫杯状病毒的ORFs对FCV体外复制差异的影响。我们将FCV的ORFs分为ORF1和ORF2-3两个部分,分别以FCV 2280和FCV F9为病毒骨架进行替换,构建四个嵌合质粒,并拯救出嵌合病毒。通过对ORF嵌合病毒与亲本病毒的生物学分析,三个ORF对病毒的生长均有影响。为了筛选出ORF1中影响FCV复制的基因,以FCV 2280为病毒骨架,将FCV F9的ORF1中的六个非结构蛋白进行替换,构建四个嵌合质粒并拯救出嵌合病毒。结果显示,替换p39和p30-VPg蛋白后FCV的复制能力表现出显著降低。随后,我们又以FCV F9为病毒骨架,将FCV 2280的ORF1中的p39和p30-VPg蛋白嵌合替换,拯救出嵌合病毒并结果进行验证,结果表明p30-VPg对FCV复制能力有显著提升。通过对基因嵌合病毒与亲本病毒的生物学分析,结果表明猫杯状病毒强弱毒替换p30-VPg对病毒生长能力影响最大。本研究中我们成功构建FCV F9感染性克隆,应用强弱毒反向遗传系统拯救出10株嵌合病毒,筛选出p30-VPg是对FCV复制影响最大的非结构蛋白。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词
• 1 文献综述
•   1.1 猫杯状病毒分子生物学
•     1.1.1 猫杯状病毒概述
•     1.1.2 杯状病毒科
•     1.1.3 猫杯状病毒基因组
•   1.2 流行病学
•   1.3 猫杯状病毒反向遗传学研究进展
•   1.4 杯状病毒非结构蛋白研究进展
•     1.4.1 复制复合物
•     1.4.2 NTPase
•     1.4.3 VPg蛋白
•     1.4.4 PP蛋白
•   1.5 研究目的及意义
• 2 嵌合FCV F9株反向遗传系统的建立
•   2.1 材料方法
•     2.1.1 毒株、细胞和载体
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 主要仪器设备
•     2.1.4 序列分析及引物的设计
•     2.1.5 FCV全长cDNA的分段鉴定
•     2.1.6 pOK-12载体的改造
•     2.1.7 F9全基因组克隆的构建
•     2.1.8 rFCV F9病毒的拯救
•     2.1.9 rFCV F9的鉴定
•   2.2 结果
•     2.2.1 FCV全长cDNA的分段鉴定
•     2.2.2 pOK-12载体的改造
•     2.2.3 F9全基因组克隆的构建
•     2.2.4 rFCV F9病毒的拯救
•     2.2.5 rFCV F9的鉴定
•   2.3 讨论
•   2.4 小结
• 3 差异基因的筛选
•   3.1 材料方法
•     3.1.1 质粒与细胞
•     3.1.2 主要试剂
•     3.1.3 主要仪器设备
•     3.1.4 序列分析与引物的设计
•     3.1.5 ORFs嵌合病毒感染性克隆的构建
•     3.1.6 ORFs嵌合病毒的拯救
•     3.1.7 ORFs嵌合病毒的鉴定
•     3.1.8 基因嵌合病毒感染性克隆的构建
•     3.1.9 基因嵌合病毒的拯救
•     3.1.10 基因嵌合病毒的鉴定
•   3.2 结果
•     3.2.1 ORFs感染性克隆的构建
•     3.2.2 ORFs嵌合病毒的拯救
•     3.2.3 ORFs嵌合病毒的鉴定
•     3.2.4 基因嵌合病毒感染性克隆的构建
•     3.2.5 基因嵌合病毒的拯救
•     3.2.6 基因嵌合病毒的鉴定
•   3.3 讨论
•   3.4 小结
• 4 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 个人简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 左智敏

导师: 曲连东

关键词: 猫杯状病毒,反向遗传,嵌合病毒,病毒复制能力

来源: 黑龙江八一农垦大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 黑龙江八一农垦大学

分类号: S852.65

总页数: 73

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