青枯菌copSRABCD基因簇铜抗性作用机理及表达调控研究

论文摘要

植物细菌性青枯病（bacterial wilt of plants）是由雷尔氏菌属植物致病种（Ralstonia spp.泛称青枯菌）引起的一种世界性分布的重大土传病害。作为防治青枯病等细菌性病害的重要杀菌剂,铜制剂的广泛使用造成多种植物病原细菌群体中出现了铜抗性菌株。全基因组序列测定表明,青枯菌Po82菌株大质粒上普遍携带了丁香假单胞菌中的铜抗性编码基因copSRABCD的同源物。以青枯菌Po82菌株为研究对象,通过反向遗传学的研究手段,构建copA、copD、copSR基因缺失菌株及相应互补菌株。解析了copA、copD、copSR基因与青枯菌铜胁迫应答、代谢活性、致病力和运动性等表型生物学特征之间的关系以及copSRABCD基因簇的表达调控关系。应用RNA-seq测序技术,测定Po82菌株以及copABCD基因缺失菌株在营养丰富培养条件、铜诱导培养以及寄主体内环境的转录本,发掘不同培养条件下共表达与差异表达的基因,以期探明copSRABCD基因簇的功能并发掘新的铜抗性及致病相关基因,为进一步深入解析青枯菌寄主及环境适应性进化的分子机理奠定基础。1.铜抗性候选基因copA、copD、copSR基因功能验证铜MIC测定结果表明Po82△copA、Po82△copD及Po82△copSR菌株的铜抗性MIC值都较野生型菌株降低。致病力测定结果表明,相较于野生型菌株,Po82△copA菌株的致病力下降,Po82△copSR菌株的致病力增强,而Po82△copD菌株的致病力没有显著差异。生长曲线结果表明,在铜胁迫的环境中,copA、copD缺失菌株影响青枯菌的生长速率。运动性测定结果表明,copA基因与青枯菌的运动能力无关,copD、copSR基因的缺失影响青枯菌的运动能力。并且copA的缺失导致青枯菌对α-D-葡萄糖和D-海藻糖等碳源,L-丙氨酸和葡萄糖醛酰胺等氮源的代谢利用速率降低。2.铜抗性基因簇表达调控测定qRT-PCR结果显示copSRABCD基因簇的表达受到铜离子的诱导,copABCD基因的表达量随着CuSO4浓度的增加而增加,证实了该基因簇为诱导型表达。RT-PCR结果显示,copABCD为同一转录单位,copSR为同一转录单位。通过测定copSR基因缺失菌株中copABCD基因的表达模式,明确了copSR对copABCD基因的调控方式为负调控。3.青枯菌离体与体内转录组学研究研究明确了离体培养条件下,亚抑制铜浓度水平诱导不仅可正调控Po82和Po82△copABCD菌株铜抗性相关基因的表达,相当数量的致病相关基因的表达也显著上调。上调表达的致病相关基因大部分为hrp基因簇的组成基因和III型效应子（T3Es）编码基因。此外,离体铜诱导培养条件下,Po82和Po82△copABCD菌株中的czcABC、fur、marR等重金属和抗生素调控基因的表达量显著上调。在寄主体内环境中,copABCD基因簇缺失菌株上调表达Ⅳ型菌毛编码基因及致病相关基因。转录组测序结果为进一步明确copSRABCD基因簇的功能并发掘新的铜抗性及致病相关基因奠定基础。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 英文缩略表
• 第一章 引言
•   1.1 青枯菌的简介
•     1.1.1 青枯菌及其危害
•     1.1.2 青枯菌的分类
•     1.1.3 青枯病的症状及青枯菌侵染循环
•     1.1.4 青枯病的防治
•     1.1.5 青枯菌的毒力调控网络
•       1.1.5.1 青枯菌的毒力因子
•       1.1.5.2 青枯菌毒力因子的调控
•   1.2 微生物抗铜基因研究进展
•     1.2.1 细菌抗铜基因研究进展
•     1.2.2 抗铜基因的调节
•     1.2.3 抗铜基因与致病性
•     1.2.4 抗铜基因与其他金属或抗生素协同抗性
•   1.3 转录组测序技术研究进展
•     1.3.1 差异基因表达研究方法
•     1.3.2 转录组测序技术在青枯菌中的应用
•   1.4 研究目的意义与技术路线
•     1.4.1 研究目的与意义
•     1.4.2 研究的技术路线
• 第二章 青枯菌铜抗性候选基因copA、copD生物学功能研究
•   2.1 试验材料
•     2.1.1 材料、试剂与仪器
•     2.1.2 菌株培养条件
•   2.2 试验方法
•     2.2.1 序列分析与系统进化树的构建
•     2.2.2 敲除载体及菌株构建
•     2.2.3 互补载体及菌株构建
•     2.2.4 铜抗性MIC值测定
•     2.2.5 生长曲线测定
•     2.2.6 致病性测定
•     2.2.7 代谢活性测定
•     2.2.8 运动性测定
•     2.2.9 基因的表达量测定
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 copA基因系统进化分析
•     2.3.2 copA、copD基因敲除载体和菌株的筛选与鉴定
•     2.3.3 copA、copD基因互补载体和菌株的筛选与鉴定
•     2.3.4 copA、copD基因的缺失导致青枯菌对铜离子耐受能力降低
•     2.3.5 copA、copD基因影响青枯菌的生长速率
•     2.3.6 copA、copD基因的缺失导致青枯菌致病性降低
•     2.3.7 copA、copD基因缺失对青枯菌代谢活性的影响
•     2.3.8 copA、copD基因的缺失对青枯菌的运动性的影响
•   2.4 分析与讨论
• 第三章 青枯菌铜抗性基因簇copSRABCD表达调控分析
•   3.1 试验材料
•     3.1.1 材料、试剂与仪器
•     3.1.2 菌株培养条件
•   3.2 试验方法
•     3.2.1 ICP-MS测定青枯菌对铜的累积隔离
•     3.2.2 铜对copSRABCD基因的诱导表达情况分析
•     3.2.3 copSR及 copABCD共转录验证
•     3.2.4 copSR敲除载体及菌株构建
•     3.2.5 copSR互补载体及菌株构建
•     3.2.6 copSR基因生物学功能测定
•     3.2.7 copSR基因对copABCD基因表达调控分析
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 青枯菌对铜的累积隔离
•     3.3.2 铜对copSRABCD基因的诱导表达情况分析
•     3.3.3 copSR及copABCD共转录验证
•     3.3.4 copSR基因敲除载体及菌株构建
•     3.3.5 copSR基因互补载体和菌株的筛选与鉴定
•     3.3.6 copSR基因基础生物学功能测定
•     3.3.7 copSR基因对copABCD基因表达调控分析
•   3.4 分析与讨论
• 第四章 青枯菌铜诱导与侵染的转录组分析
•   4.1 试验材料
•     4.1.1 材料、试剂与仪器
•     4.1.2 菌株培养条件
•   4.2 试验方法
•     4.2.1 富营养培养基菌株培养及取样
•     4.2.2 番茄接种与取样
•     4.2.3 文库构建和转录组测序
•     4.2.4 转录组生物信息学分析
•     4.2.5 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证
•   4.3 结果与分析
•     4.3.1 RNA质量检测
•     4.3.2 RNA测序质量评估
•     4.3.3 质量控制后数据统计
•     4.3.4 测序深度饱和性评估
•     4.3.5 基础培养基中转录组分析
•     4.3.6 青枯菌侵染过程中转录组分析
•   4.4 结果与讨论
• 第五章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王晓宁

导师: 曹坳程

关键词: 铜抗性,基因表达调控,转录组,致病性

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,农业基础科学,植物保护

单位: 中国农业科学院

分类号: S432.42

总页数: 97

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