2-酮基-L-古龙酸合成相关脱氢酶的酶学性质及催化研究

论文摘要

2-酮基-L-古龙酸（2-keto-L-gulonic acid,2-KLG）可以通过内酯化反应转化成维生素C,是维生素C工业生产的直接前体。2-KLG主要采用经典两步发酵法生产,该方法主要包括三菌两步发酵过程。相对于一般纯种一步发酵,该方法存在能耗高、发酵时间长、调控困难等问题。随着现代工业整体水平的提升,对经典两步发酵法的改进变得尤为迫切。目前为止,在自然界中并未发现维生素C或2-KLG高产菌株。通过构建重组菌株实现维生素C一步发酵生产是改进维生素C生产方法最具潜力的策略。为了构建维生素C（或2-KLG）合成途径,首先需要寻找并鉴定2-KLG合成酶系并研究其功能。本研究基于经典两步发酵法中涉及的酶催化过程,通过分析经典两步发酵法中2-KLG合成相关脱氢酶催化性质,鉴定2-KLG合成途径关键脱氢酶。构建重组大肠杆菌并实现混菌一步发酵D-山梨醇合成2-KLG。主要研究结果如下:1.通过在大肠杆菌中表达吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone,PQQ）合成基因簇实现大肠杆菌合成PQQ。PQQ是除核苷酸和黄素类辅酶以外的第三类辅酶。在维生素C经典两步发酵法中,2-KLG合成相关脱氢酶大多以PQQ为辅酶,尤其是来源于普通生酮基古龙酸菌的山梨糖/山梨酮脱氢酶（sorbose/sorbosone dehydrogenases,SSDHs）和山梨酮脱氢酶（sorbosone dehydrogenases,SNDHs）。大肠杆菌本身不能合成PQQ。本研究通过文献检索确定可以合成PQQ的几种菌株,包括氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003、扭脱甲基杆菌AM1、甲基营养菌MP688和肺炎克雷伯氏菌HS11286。通过基因组分析得到各菌株中PQQ合成基因簇。在大肠杆菌中表达来源于上述菌株的PQQ合成基因簇,实现在大肠杆菌中合成PQQ。通过摇瓶发酵及IPTG诱导,重组大肠杆菌产PQQ浓度达到357.5μg/L。2.通过在大肠杆菌中共表达山梨醇脱氢酶（sorbitol dehydrogenase,SLDH）和PQQ合成基因簇实现大肠杆菌发酵D-山梨醇产L-山梨糖。通过对氧化葡萄糖酸杆菌基因组进行分析,得到三种山梨醇脱氢酶SldBA1、SldBA2和SldSLC的基因序列。通过将3个脱氢酶在大肠杆菌中进行外源表达及活性验证,发现山梨醇脱氢酶SldBA1、SldBA2和SldSLC均有D-山梨醇催化活性。SldBA1和SldBA2可催化D-山梨醇生成L-山梨糖,辅因子均为PQQ,而SldSLC的功能可能是催化D-山梨醇生成D-果糖。通过摇瓶发酵验证,推测山梨醇脱氢酶SldBA1是氧化葡萄糖酸杆菌催化D-山梨醇生成L-山梨糖主要的酶。通过共表达SldBA1和PQQ合成基因簇构建重组大肠杆菌,摇瓶发酵D-山梨醇生产L-山梨糖,L-山梨糖最高浓度为3.8 g/L,转化率为40.8%。3.对来源于普通生酮基古龙酸菌的2-KLG合成相关脱氢酶进行表达、纯化和酶学性质分析。普通生酮基古龙酸菌中存在5种山梨糖/山梨酮脱氢酶,即SSDA1、SSDA1-P、SSDA2、SSDA3和SSDB,以及两种山梨酮脱氢酶,即GSNDH和SNDH。在大肠杆菌中过表达并纯化上述7种脱氢酶并进行酶学性质分析。发现7种脱氢酶均以PQQ为辅酶。5种山梨糖/山梨酮脱氢酶均对正丙醇和乙二醛有较高活性,然而仅SSDA1和SSDA3可以直接催化L-山梨糖生成2-KLG。除乙二醛外,两种山梨酮脱氢酶对D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-木糖、L-鼠李糖和D-乳糖也具有较高活性。7种酶的最适温度均为30°C左右,最适pH均偏碱性,对钙或镁离子有依赖性。电子受体的添加对酶活力有很大影响。4.利用表达山梨糖/山梨酮脱氢酶（SSDA1或SSDA3）的大肠杆菌全细胞催化L-山梨糖产2-KLG。通过全细胞催化反应发现,表达SSDA1或SSDA3的大肠杆菌可以在添加辅酶PQQ和电子受体（PMS或DCIP）时,催化L-山梨糖合成2-KLG。缺少电子受体时,催化反应无法进行,无2-KLG生成。发现低pH值和产物2-KLG积累对催化反应具有强烈的抑制作用。通过共表达SSDA1/3和PQQ合成基因簇构建两株2-KLG合成菌株。利用2-KLG合成菌株做全细胞催化,在添加电子受体情况下,在摇瓶中实现产2-KLG浓度为11.2 g/L或12.4 g/L,转化率分别为56.8%或61.7%。5.利用氧化葡萄糖酸杆菌和大肠杆菌重组菌混合培养实现混菌一步发酵D-山梨醇产2-KLG。基于摇瓶上全细胞催化反应优化条件,在发酵罐中进行全细胞催化。通过控制pH并添加电子受体催化L-山梨糖合成2-KLG。催化46 h,产物2-KLG浓度为72.4g/L,转化率达到71.2%。通过将氧化葡萄糖酸杆菌以及共表达SSDA3和PQQ合成基因簇的大肠杆菌混合发酵。在氧化葡萄糖酸杆菌和大肠杆菌接种比例为2:1,前期不控制pH,后期控制pH7.5同时添加电子受体条件下,实现一步发酵D-山梨醇产2-KLG。混菌一步发酵最高2-KLG产量为16.8 g/L,转化率为33.6%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 概述
•   1.2 国内外研究进展
•     1.2.1 两步发酵法产维生素C研究
•     1.2.2 一步发酵产维生素C研究进展
•     1.2.3 一步发酵产维生素C面临的挑战
•   1.3 本论文主要研究内容
•     1.3.1 选题的立题依据和研究意义
•     1.3.2 主要研究内容
• 第二章 代谢工程改造大肠杆菌合成辅酶PQQ
•   2.1 前言
•   2.2 材料与方法
•     2.2.1 菌株和质粒
•     2.2.2 试剂及培养基
•     2.2.3 仪器
•     2.2.4 分子生物学操作
•     2.2.5 重组菌构建
•     2.2.6 重组大肠杆菌的诱导表达
•     2.2.7 PQQ的检测及定量方法
•   2.3 结果与讨论
•     2.3.1 葡萄糖脱氢酶的表达
•     2.3.2 大肠杆菌中表达不同来源的PQQ合成基因簇
•     2.3.3 不同载体表达PQQ合成基因簇
•     2.3.4 过表达PQQ合成基因强化PQQ合成
•   2.4 本章小结
• 第三章 山梨醇脱氢酶的表达及D-山梨醇的转化
•   3.1 前言
•   3.2 材料与方法
•     3.2.1 菌株和质粒
•     3.2.2 主要试剂及培养基
•     3.2.3 山梨醇脱氢酶表达载体及菌株构建
•     3.2.4 产L-山梨糖重组大肠杆菌的构建
•     3.2.5 SDS-PAGE蛋白表达分析
•     3.2.6 大肠杆菌发酵D-山梨醇
•     3.2.7 D-山梨醇和L-山梨糖检测
•   3.3 结果与讨论
•     3.3.1 山梨醇脱氢酶的表达
•     3.3.2 山梨醇脱氢酶表达菌株酶活验证
•     3.3.3 外源添加辅酶PQQ发酵D-山梨醇产L-山梨糖
•     3.3.4 大肠杆菌发酵D-山梨醇产L-山梨糖
•   3.4 本章小结
• 第四章 山梨糖/山梨酮脱氢酶和山梨酮脱氢酶的表达及酶学性质分析
•   4.1 前言
•   4.2 材料与方法
•     4.2.1 菌株和质粒
•     4.2.2 主要试剂及培养基
•     4.2.3 SSDHs和 SNDHs表达载体及菌株构建
•     4.2.4 SSDHs和 SNDHs的诱导表达
•     4.2.5 SDS-PAGE蛋白表达分析
•     4.2.6 蛋白纯化方法
•     4.2.7 蛋白浓度测定
•     4.2.8 酶活和比酶活测定
•     4.2.9 SSDHs和 SNDHs底物谱测定
•     4.2.10 脱氢酶最适反应温度、最适反应pH值和热稳定性测定
•     4.2.11 测定常见金属离子的添加对酶活力的影响
•     4.2.12 SSDHs和 SNDHs酶促反应动力学分析
•     4.2.13 不同电子受体不同波长光吸收性质分析
•     4.2.14 不同电子受体对SSDHs和 SNDHs酶活的影响
•     4.2.15 体外催化产物的高效液相色谱定量检测方法
•   4.3 结果与讨论
•     4.3.1 山梨糖/山梨酮脱氢酶和山梨酮脱氢酶的分析及诱导表达
•     4.3.2 脱氢酶的纯化及验证
•     4.3.3 脱氢酶酶促反应动力学分析
•     4.3.4 SSDHs和 SNDHs最适反应温度、最适反应pH值和热稳定性
•     4.3.5 SSDHs和 SNDHs对常见糖醇类底物的转化能力分析。
•     4.3.6 不同电子受体的添加对酶活测定试验的干扰验证。
•     4.3.7 不同电子受体的添加对酶活的影响。
•     4.3.8 不同金属离子的添加对脱氢酶酶活的影响。
•   4.4 本章小结
• 第五章 重组大肠杆菌全细胞催化L-山梨糖合成2-KLG
•   5.1 前言
•   5.2 材料与方法
•     5.2.1 菌株和质粒
•     5.2.2 主要试剂及培养基
•     5.2.3 产PQQ的脱氢酶表达菌株构建
•     5.2.4 重组大肠杆菌诱导表达
•     5.2.5 全细胞转化L-山梨糖产2-KLG
•   5.3 结果与讨论
•     5.3.1 山梨糖/山梨酮脱氢酶过表达重组细胞合成2-KLG能力验证
•     5.3.2 添加2-KLG对全细胞催化的影响
•     5.3.3 不同浓度重组细胞催化L-山梨糖产2-KLG
•     5.3.4 pH对全细胞催化的影响
•     5.3.5 电子受体对全细胞催化的影响
•     5.3.6 PQQ合成重组菌株产2-KLG情况
•   5.4 本章小结
• 第六章 发酵罐小试合成2-KLG
•   6.1 前言
•   6.2 材料与方法
•     6.2.1 菌株和质粒
•     6.2.2 主要试剂及培养基
•     6.2.3 氧化葡萄糖酸杆菌发酵D-山梨醇
•     6.2.4 重组大肠杆菌诱导和5 L罐上全细胞催化
•     6.2.5 5L罐上混菌发酵D-山梨醇
•   6.3 结果与讨论
•     6.3.1 氧化葡萄糖酸杆菌发酵D-山梨醇产L-山梨糖
•     6.3.2 大肠杆菌重组菌添加PMS和 DCIP催化L-山梨糖产2-KLG
•     6.3.3 大肠杆菌重组菌添加PMS催化L-山梨糖产2-KLG
•     6.3.4 混菌发酵D-山梨醇产2-KLG
•   6.4 本章小结
• 主要结论与展望
•   主要结论
•   展望
• 论文创新点
• 致谢
• 参考文献
• 附录Ⅰ：作者在攻读博士学位期间发表的论文
• 附录Ⅱ：不同来源PQQ合成基因簇序列

文章来源

类型: 博士论文

作者: 王盼盼

导师: 陈坚

关键词: 维生素,酮基古龙酸,吡咯喹啉醌,山梨醇脱氢酶,山梨糖脱氢酶,山梨糖,山梨酮脱氢酶

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,化学,一般化学工业

单位: 江南大学

分类号: TQ921;O629.4

总页数: 97

文件大小: 5192K

下载量: 204