β-甘露聚糖酶和糖苷水解酶Ttxy43性质分析及高效利用木糖的酿酒酵母工程菌株的构建

论文摘要

半纤维素是自然界中含量仅次于纤维素的聚合物,其中木聚糖是含量最高的半纤维素,甘露聚糖次之。它们的降解利用需要大量的半纤维素酶的协同作用,木聚糖降解后的主要产物木糖可以通过微生物的发酵作用生成乙醇,而甘露聚糖的降解产物低聚甘露糖（MOS）则是一种重要的新型的益生元。本文作者拟在酿酒酵母内高效表达来源于硫色曲霉的β-甘露聚糖酶,并研究其在MOS生产中的作用;利用定点突变尝试阐明一个属于糖苷水解酶家族43（GH 43）的三功能酶Ttxy43的作用机理;并构建能够直接利用木糖的酿酒酵母菌株。酿酒酵母是研究真核生物的模式菌株,并且被食品药品监督管理局认定是安全的菌株,为了在其中高效的表达β-甘露聚糖酶,本文作者利用不同的策略构建了五种不同类型的表达菌株,它们由单倍体、双倍体、组成型表达、诱导型表达、外源基因游离、整合型表达通过不同方式组合而来,并分别测试了这些菌株在半合成培养基或合成培养基中的β-甘露聚糖酶的表达情况,最终确定β-甘露聚糖酶基因整合的组成型表达的单倍体菌株TIB作为该酶的生产菌株,通过高密度培养,β-甘露聚糖酶的生产强度达到16 U/mL/day,该酶的最适反应pH和温度分别为3.2和60℃,在以槐豆胶（LBG）或魔芋甘露聚糖（KGM）分别为底物时,km为24.13 mg/mL或33 mg/mL,max为715 μumol/min/mg或625 μmol/min/mg,而利用其生产MOS时,最高水解效率达到73.7%,水解产物包括甘露糖、甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖、甘露六糖等。本室Abdul Basit等发现了一个属于糖苷水解酶家族43（GH 43）的三功能酶Ttxy43,该酶分别具有β-木糖苷酶,α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和内切-1,4-β-木聚糖酶酶活,其最适反应βH分别为6.0、7.0和7.0,最适反应温度分别为50℃、50℃和60℃。为了阐明其催化机制,本文作者分别构建了 134Asp、228Glu、31Gla、170Glu、176Glu定点突变为Ala的突变株,分别命名为D134A、E228A、E31A、E170A和E176A,结果表明突变株D134A或E228A的三种酶活均为0,说明134Asp和228Glu对于该酶的酶活起到重要作用,不同酶活性的底物的催化降解很可能是在同一活性中心完成的。另外,E176A突变株的β-木糖苷酶和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶酶活性分别下降55%和49%,说明176Glu在两种酶活发挥作用时起到了重要作用。酿酒酵母基因组中有几百个长的末端重复序列（LTR）称为δ序列,它可以做为外源基因整合的位点。酿酒酵母本身不能利用木糖,本文作者在营养缺陷型酿酒酵母BY4741的基础上通过δ位点随机整合的方法导入来源于黑曲霉的和木糖的利用相关的基因木糖还原酶基因XR（Xylose reductase）、木糖醇脱氢酶基因XDH（Xylitol dehydrogenase）和木酮糖激酶基因XKS（Xylulokinase）,构建了利用木糖的酿酒酵母菌株RHS,并在此基础上敲除保守的磷酸酶基因PHO13,再整合含有点突变（R277H）的木糖还原酶基因得到优化菌株RHS△PM,氧限制条件下以木糖为单一碳源时菌株RHS△PM在80 h内消耗40 g/L木糖,生成10 g/L的乙醇。综上所述,β-甘露聚糖酶的研究扩展了甘露聚糖的应用范围,为工业应用提供可能,Ttxy43的研究为接下来进一步解释该酶的工作机理,提高木聚糖直接转化为木糖的效率提供可能,而利用木糖的酿酒酵母菌株的构建则能直接将木糖发酵生产乙醇,为木糖和木聚糖的直接利用提供理论基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
•   1.1 半纤维素和半纤维素酶类
•   1.2 甘露聚糖和甘露聚糖酶
•   1.3 木聚糖、木聚糖降解相关酶类及木糖的利用
•   1.4 酵母外源表达系统及在半纤维素酶生产中的应用
•   1.5 本文研究目的及意义
• 第二章 材料和方法
•   2.1 质粒、菌株和引物
•   2.2 培养基
•   2.3 分子相关实验
•   2.4 蛋白相关实验
•   2.5 酶学相关实验
•   2.6 菌株培养及性质分析
•   2.7 分析方法
• 第三章 酿酒酵母外源表达甘露聚糖酶及性质分析
•   3.1 前言
•   3.2 序列分析预测
•   3.3 表达菌株构建
•   3.4 表达菌株比较与分析
•   3.5 甘露聚糖酶初步纯化及性质分析
•   3.6 小结与讨论
• 第四章 三功能糖苷水解酶Ttxy43作用机理探究
•   4.1 前言
•   4.2 序列比对及功能预测
•   4.3 酶性质分析
•   4.4 三维结构预测及定点突变
•   4.5 定点突变菌株构建及性质分析
•   4.6 小结与讨论
• 第五章 木糖利用型酿酒酵母的构建及优化
•   5.1 前言
•   5.2 木糖利用相关基因分析
•   5.3 菌株构建
•   5.4 菌株优化及构建
•   5.5 菌株性质比较和分析
•   5.6 小结与讨论
• 第六章 结论与展望
•   6.1 结论
•   6.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录
•   附录A
•   附录B
• 个人简介

文章来源

类型: 博士论文

作者: 刘军权

导师: 姜伟

关键词: 甘露聚糖酶,家族,木糖利用,酿酒酵母

来源: 中国农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 中国农业大学

分类号: Q55

总页数: 146

文件大小: 15311K

下载量: 483