ALK在哺乳动物大脑皮层发育中的作用及机制研究

论文摘要

中枢神经系统发育中各个步骤的精确调控对哺乳动物大脑正常结构的形成和功能的行使至关重要,许多信号通路与调控这个极其复杂的过程。间变性淋巴瘤激酶(Anaplastic lymphoma kinase,ALK)是受体酪氨酸激酶家族的一员,在胚胎发育时期特异且大量表达于中枢神经系统中。在临床上,以ALK为靶点的小分子抑制剂已经被用于治疗包括神经母细胞瘤在内的癌症中,但是关于ALK在哺乳动物大脑发育的过程中具体有着怎样的生理功能,尚未有明确的答案。在本研究中,我们利用小分子抑制剂和shRNA操控胚胎期小鼠大脑,培养的人源神经前体细胞和人类大脑类器官中的ALK信号通路,采用弥散张量成像(diffusion tensor imaging,DTI),免疫荧光染色,流式细胞术和行为学测试等研究方法检测了ALK在哺乳动物神经前体细胞的增殖与凋亡和大脑皮层发育中的作用。首先,我们发现胚胎期短暂的抑制ALK的活性便会导致成年小鼠大脑中神经纤维连接的异常,并表现出焦虑性的行为和认知障碍。免疫荧光染色的结果表明,胚胎时期ALK活性被短期抑制后,神经元的产生显著减少,迁移速度有一定滞后,这些缺陷会使小鼠在成年后大脑的结构异常,正常功能行使受到影响。接着,为了检测这些在小鼠大脑中观察到的表型与人类大脑皮层的发育是否具有对应性,我们在培养的人源神经前体细胞和人源大脑皮层类器官中分别进行了类似的实验,发现ALK活性受到抑制后,人源神经前体细胞增殖也有显著降低,表型与我们在小鼠中观测到的一致。最后,利用单细胞测序技术,我们分析了ALK活性抑制对人源大脑皮层类器官中不同神经类细胞的转录组造成的影响。本研究不仅为ALK可以通过促进神经细胞的增殖、存活和迁移参与调控哺乳动物大脑皮层发育提供了多方面的证据,还发现处于发育不同阶段的神经类细胞对ALK的活性抑制会做出不同的应答反应,为参与调控哺乳动物大脑皮层发育过程的分子版图补充了一条重要的通路。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 主要缩略词表
• 前言
• 第一章 文献综述
•   1.1 大脑皮层
•     1.1.1 大脑皮层的结构
•     1.1.2 大脑皮层的组成
•   1.2 大脑皮层的发育
•     1.2.1 神经前体细胞
•       1.2.1.1 神经前体细胞的类型
•       1.2.1.2 神经前体细胞的分裂方式
•     1.2.2 神经元
•       1.2.2.1 神经元产生的时间与位置
•       1.2.2.2 神经元的迁移
•       1.2.2.3 神经元的类型
•   1.3 大脑皮层发育的调控
•     1.3.1 前体细胞增殖与分化的调控
•     1.3.2 神经元迁移的调控
•     1.3.3 大脑皮层发育异常相关疾病
•   1.4 大脑皮层的进化
•     1.4.1 不同种哺乳动物大脑皮层的形态
•     1.4.2 大脑皮层的扩展
•       1.4.2.1 皮层扩展的基础
•       1.4.2.2 皮层的扩展的模式
•   1.5 大脑皮层类器官
•   1.6 间变性淋巴瘤激酶
•     1.6.1 ALK的结构与其配体
•     1.6.2 ALK的生理功能
•     1.6.3 ALK相关信号通路
•       1.6.3.1 PI3K/Akt通路
•       1.6.3.2 Ras/ERK通路
•       1.6.3.3 JAK3/STAT3 通路
•       1.6.3.4 PLC-γ通路
•       1.6.3.5 MYCN
•     1.6.4 ALK与肿瘤
•     1.6.5 ALK靶向药物
•   1.7 本研究拟解决的问题
• 第二章 实验材料与方法
•   2.1 实验动物、试剂与仪器
•     2.1.1 实验动物
•     2.1.2 实验试剂
•     2.1.3 实验仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 ALK-shRNA重组质粒构建
•     2.2.2 RNA提取、反转录与Real Time PCR
•     2.2.3 蛋白质免疫印记
•     2.2.4 流式细胞术
•     2.2.5 胚胎侧脑室注射
•     2.2.6 子宫内胚胎电转
•     2.2.7 冰冻切片样品处理
•     2.2.8 神经前体细胞诱导与培养
•     2.2.9 大脑皮层类器官的培养
•     2.2.10 细胞转染
•     2.2.11 免疫荧光染色
•     2.2.12 显微镜设置、图像采集与分析
•     2.2.13 功能性核磁共振
•     2.2.14 行为学测试
•     2.2.15 单细胞悬液制备
• 第三章 实验结果
•   3.1 神经发育时期干扰ALK活性影响成年小鼠大脑功能
•     3.1.1 研究目的
•     3.1.2 实验结果
•       3.1.2.1 胚胎期药物干扰ALK活性导致神经纤维投射异常
•       3.1.2.2 胚胎期ALK活性异常引起成年时期行为学缺陷
•   3.2 ALK参与调控小鼠大脑皮层发育
•     3.2.1 研究目的
•     3.2.2 实验结果
•       3.2.2.1 ALK参与调控神经前体细胞的增殖
•       3.2.2.2 抑制ALK通路影响神经元迁移
•   3.3 ALK参与调控人源神经前体细胞增殖
•     3.3.1 研究目的
•     3.3.2 实验结果
•       3.3.2.1 神经前体细胞中ALK通路活性抑制
•       3.3.2.2 ALK活性抑制影响神经前体细胞的细胞周期并导致细胞凋亡
•   3.4 ALK信号通路影响人源大脑皮层类器官的发育
•     3.4.1 研究目的
•     3.4.2 实验结果
•       3.4.2.1 ALK影响人源大脑皮层类器官中神经细胞增殖
•       3.4.2.2 ALK活性调控人源大脑皮层类器官的正常组装
•   3.5 ALK活性抑制对神经类细胞的转录调控
•     3.5.1 研究目的
•     3.5.2 实验结果
•       3.5.2.1 ALK活性抑制不影响类器官中神经类细胞的分化
•       3.5.2.2 ALK活性抑制导致大脑皮层类器官发育延迟
•       3.5.2.3 ALK通过不同的机制调控神经前体细胞与神经元的活动
• 第四章 讨论与展望
•   4.1 ALK在小鼠大脑皮层发育中的作用
•   4.2 ALK通路对人源神经前体细胞的影响
•   4.3 参与ALK通路调控神经类细胞活动的分子
•   4.4 本研究的意义与潜在的后续研究方向
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介

文章来源

类型: 博士论文

作者: 毛蕊

导师: 加正平

关键词: 间变性淋巴瘤激酶,神经发育,皮层类器官,神经前体细胞,单细胞测序

来源: 东南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 东南大学

分类号: Q42

DOI: 10.27014/d.cnki.gdnau.2019.004074

总页数: 121

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